范瑩瑩　才毛　楊鳳梅

中圖分類(lèi)號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）02-0163-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.05

摘 要 目的：提高七味馬錢(qián)子丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中訶子、木香進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中羥基紅花黃色素 A、馬錢(qián)子堿和士的寧的含量，色譜柱為Phenomenex Prodigy C18，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26 ∶ 2 ∶ 72，V/V/V，羥基紅花黃色素 A）、乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉和0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（以10%磷酸溶液調(diào)pH至2.8）（21 ∶ 79，V/V，馬錢(qián)子堿和士的寧），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm（羥基紅花黃色素 A）、260 nm（馬錢(qián)子堿、士的寧），柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：訶子、木香的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。羥基紅花黃色素A、馬錢(qián)子堿和士的寧檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為6.29～62.94 μg/mL（r=0.999 3）、1.83～18.30 μg/mL（r=0.999 4）、2.11～21.11 μg/mL（r=0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%（n=6）；加樣回收率分別為101.66%～104.91%（RSD=1.14%，n=6）、99.58%～104.55%（RSD=1.75%，n=6）、101.22%～104.04%（RSD=0.99%，n=6）。結(jié)論：提高的標(biāo)準(zhǔn)可更好地用于七味馬錢(qián)子丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 七味馬錢(qián)子丸；訶子；木香；羥基紅花黃色素 A；馬錢(qián)子堿；士的寧；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

ABSTRACT OBJECTIVE： To improve the quality standard for Qiwei maqianzi pills. METHODS： TLC was used for the qualitative identification of Chebulae Fructus and Aucklandiae Radix in the preparation. HPLC method was used for the content determination of hydroxy safflor yellow A， brucine and strychnine in preparation. The determination was performed on Phenomenex Prodigy C18 column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid soulution（26 ∶ 2 ∶ 72，V/V/V， for hydroxy safflor yellow A）， acetonitrile-0.01 mol/L sodium heptanesulfonate mixed with same quantity of 0.02 mol/L potassium dihydrogen phosphate （pH adjusted to 2.8 using 10% phosphoric acid， 21 ∶ 79，V/V， for brucine and strychnine） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 403 nm （for hydroxy safflor yellow A） and 260 nm （for brucine and strychnine）. The column temperature was 25 ℃， and the injection volume was 10 μL. RESULTS： TLC spots of Chebulae Fructus and Aucklandiae Radix were clear and well-separated without interference from negative control. The linear range was 6.29-62.94 μg/mL for hydroxy safflor yellow A（r=0.999 3）， 1.83-18.30 μg/mL for brucine（r=0.999 4） and 2.11-21.11 μg/mL for strychnine（r=0.999 6）.RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 2.0%. The recoveries were 101.66%-104.91%（RSD=1.14%，n=6）， 99.58%-104.55%（RSD=1.75%，n=6） and 101.22%-104.04%（RSD=0.99%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： Improved standard can be better used for quality control of Qiwei maqianzi pills.

KEYWORDS Qiwei maqianzi pills； Chebulae Fructus； Aucklandiae Radix； Hydroxy safflor yellow A； Brucine； Strychnine；TLC； HPLC； Quality standard

七味馬錢(qián)子丸由馬錢(qián)子、訶子、紅花、木香、天竺黃、乳香、沉香等7味藥材組方而成，藏文名為郭其敦巴日布，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥》（第一冊(cè)），具有清熱、行氣、活血之功效，臨床多用于治療“血隆上壅”所引發(fā)的疾病[1]，是西藏、青海等地藏醫(yī)院常規(guī)使用的醫(yī)院復(fù)方制劑。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅收載了性狀和檢查項(xiàng)，不能全面控制其質(zhì)量?；诖耍驹囼?yàn)采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中訶子和木香進(jìn)行了定性鑒別；同時(shí)，鑒于方中紅花的指標(biāo)成分羥基紅花黃色素 A不穩(wěn)定[2-3]，而主藥馬錢(qián)子所含馬錢(qián)子堿和士的寧毒性較大[4-5]，故采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了制劑中羥基紅花黃色素 A、馬錢(qián)子堿和士的寧的含量，以期為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1314F紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；AuW220D型萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；CP225D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

七味馬錢(qián)子丸由青海省湟中縣塔爾寺藏醫(yī)院（批號(hào)：20140105、20140203、20140308）、西藏自治區(qū)藏藥廠（批號(hào)：140314、140910）、青海省黃南州藏醫(yī)院（批號(hào)：20131216、20131230）和青海省久美藏醫(yī)院（批號(hào)：130709、130808、130912）提供， 規(guī)格均為0.5 g/丸；羥基紅花黃色素 A對(duì)照品（批號(hào)：111637-201106，純度：92.5%）、馬錢(qián)子堿對(duì)照品（批號(hào)：110706-200505，純度：95.9%）、士的寧對(duì)照品（批號(hào)：110705-200306，純度：97%）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-200803，純度：>98%）、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：111525-201008，純度：>98%）、訶子對(duì)照藥材（批號(hào)：121015-201004）、木香對(duì)照藥材（批號(hào)：120921-201008）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 訶子和木香的定性鑒別

2.1.1 訶子 取樣品2 g，研細(xì)，加乙醇25 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加乙醇制成沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液；取訶子對(duì)照藥材0.5 g，研細(xì)，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液；按七味馬錢(qián)子丸處方和工藝制備缺訶子的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述供試品和陰性對(duì)照溶液各5 μL、對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上；以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（6 ∶ 4 ∶ 0.5，V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)；取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，晾干，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.1.2 木香 取樣品2 g，研細(xì)，加三氯甲烷10 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，加甲醇制成去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液；取木香對(duì)照藥材0.5 g，研細(xì)，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液；按七味馬錢(qián)子丸處方和工藝制備缺木香的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述供試品和陰性對(duì)照溶液各2～5 μL、對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上；以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開(kāi)劑，10 ℃下展開(kāi)；取出，晾干，噴以5%茴香醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖2。

2.2 羥基紅花黃色素 A的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Prodigy C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26 ∶ 2 ∶ 72，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[7-9]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，加25%甲醇溶液溶解并定容，制成羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度為 0.314 7 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液5 mL，置于50 mL 量瓶中，加25%甲醇溶液定容，制成羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度為0.031 47 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約1 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加25%甲醇溶液50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理40 min；放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用25%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻；濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按七味馬錢(qián)子丸處方和工藝制備缺紅花的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖3。結(jié)果，在該色譜條件下，以羥基紅花黃色素A峰計(jì)理論板數(shù)≥3 000；羥基紅花黃色素A峰與其他相鄰峰能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度>1.5。

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加25%甲醇溶液定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以羥基紅花黃色素 A質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程y=32.48x-23.571（r=0.999 3）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素 A檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為6.29～62.94 μg/mL。

2.2.7 定量限考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，羥基紅花黃色素 A 的定量限為0.90 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，羥基紅花黃色素 A峰面積的RSD為0.55%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140105）適量，分別于室溫下放置0、3、8、12、18、20 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，羥基紅花黃色素 A峰面積的RSD為1.16%（n=6），表明供試品溶液室溫放置20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)：20140105）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，羥基紅花黃色素 A含量平均值為1.80 mg/g，RSD為1.31%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：20140105）0.5 g，共6份，分別加入一定量的羥基紅花黃色素 A對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.12 樣品中羥基紅花黃色素 A含量測(cè)定 取10批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 馬錢(qián)子堿和士的寧的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Prodigy C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉和0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液（以10%磷酸溶液調(diào)pH至2.8）（21 ∶ 79，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[10-12]。

2.3.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取馬錢(qián)子堿對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成馬錢(qián)子堿質(zhì)量濃度為 0.305 0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密稱(chēng)取士的寧對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成士的寧質(zhì)量濃度為 0.351 9 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述兩種對(duì)照品貯備液各3 mL，置于同一100 mL量瓶中，加三氯甲烷制成馬錢(qián)子堿、士的寧質(zhì)量濃度分別為9.15、10.56 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取樣品約1 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定， 置于具塞錐形瓶中，加氫氧化鈉試液7 mL，充分振搖，放置30 min；精密加三氯甲烷20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，置于水浴中回流提取2 h；放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻；用鋪有少量無(wú)水硫酸鈉的濾紙濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按七味馬錢(qián)子丸處方和工藝制備缺馬錢(qián)子的陰性樣品，并按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖4。結(jié)果，在該色譜條件下，以士的寧峰計(jì)理論板數(shù)≥3 000；馬錢(qián)子堿峰、士的寧峰與其他相鄰峰均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度>1.5。

2.3.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項(xiàng)下馬錢(qián)子堿和士的寧單一對(duì)照品貯備液0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列單一對(duì)照品溶液。精密量取上述系列單一對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以馬錢(qián)子堿和士的寧質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得馬錢(qián)子堿和士的寧回歸方程分別為y=13.927x+8.378（r=0.999 4）、y=18.005x-8.462（r=0.999 6）。結(jié)果表明，馬錢(qián)子堿和士的寧檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為1.83～18.30、2.11～21.11 μg/mL。

2.3.7 定量限考察 精密量取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，馬錢(qián)子堿和士的寧的定量限分別為0.60、0.53 μg/mL。

2.3.8 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，馬錢(qián)子堿和士的寧峰面積的RSD分別為0.71%、0.89%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20131230）適量，分別于室溫下放置0、2、8、10、16、20 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，馬錢(qián)子堿和士的寧峰面積的RSD分別為0.53%、1.06%（n=6），表明供試品溶液室溫放置20 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品（批號(hào)：20131230）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，馬錢(qián)子堿和士的寧含量平均值分別為0.79、1.28 mg/g， RSD分別為1.84%、1.95%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品（批號(hào)：20131230）適量，共6份，分別加入一定量的馬錢(qián)子堿和士的寧對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.12 樣品中馬錢(qián)子堿和士的寧含量測(cè)定 取10批樣品各適量，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中，筆者考察了木香的TLC鑒別的展開(kāi)劑，除考察了環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）外，還考察了環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V），但用后者作為展開(kāi)劑時(shí)供試品斑點(diǎn)分離較差。

在考察羥基紅花黃色素A含量測(cè)定中供試品的提取溶劑時(shí)，筆者分別選用了甲醇、50%甲醇溶液、25%甲醇溶液和乙醇等多種溶劑，結(jié)果表明，25%甲醇溶液提取的供試品色譜峰峰形較好、雜質(zhì)較少。而在考察馬錢(qián)子堿和士的寧含量測(cè)定中供試品的提取方式時(shí)，筆者分別選用了冷浸、超聲和回流提取方式，結(jié)果以回流提取最為充分。另外，將馬錢(qián)子堿和士的寧單一對(duì)照品貯備液分別進(jìn)樣后，利用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描吸收光譜，結(jié)果馬錢(qián)子堿在264 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，士的寧在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，考慮同時(shí)兼顧兩者的測(cè)定靈敏度，選擇其中間值260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由本研究結(jié)果可知，10 批七味馬錢(qián)子丸中羥基紅花黃色素A的含量為0.46～1.80 mg/g（平均為1.27 mg/g），馬錢(qián)子堿的含量為0.44～0.91 mg/g（平均為0.65 mg/g），士的寧的含量為0.69～1.31 mg/g（平均為0.92 mg/g），不同單位制備的樣品含量差異顯著。由于馬錢(qián)子堿和士的寧既是毒性成分同時(shí)也是有效成分[13]，為保證七味馬錢(qián)子丸的安全性和有效性，必須嚴(yán)格控制馬錢(qián)子堿和士的寧含量的上下限。

綜上所述，提高的標(biāo)準(zhǔn)可更好地用于七味馬錢(qián)子丸的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-05-08 修回日期：2017-11-08）

（編輯：張 靜）