付立霞，高　雯，韓先干，高　波，張曉君，劉曉丹，曾令兵

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.江蘇省人畜共患病學重點實驗室，揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；3.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

1　材料和方法

1.1　菌株、質(zhì)粒和試劑

1.2　引物設(shè)計與合成

1.3　質(zhì)粒和基因組的制備

表1　本研究中所用引物及其序列Tab.1　Primers and its sequences used in this study

注：質(zhì)粒pEI1中的CDS1(pEI1_CDS1)和pEI2中的CDS1(pEI2_CDS1)為非同源基因，為避免混淆，后續(xù)以orf1和orf2代替，以示區(qū)分。

1.4　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1質(zhì)粒pUC18-orf1的構(gòu)建

1.4.2質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的構(gòu)建

1.4.3質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2的構(gòu)建

在成功構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的基礎(chǔ)上，進一步以引物orf2-F/orf2-R擴增位于隱蔽質(zhì)粒pEI2上的預(yù)測編碼基因CDS1，最后通過上述方法將其克隆至質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的KpnⅠ和EcoRⅠ位點之間，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pUC18-luxS-orf1-orf2 (圖1)，用于后續(xù)熒光定量PCR標準曲線的建立。

圖1　質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2的物理圖譜Fig.1　Physical map of plasmid pUC18-luxS-orf1-orf2

1.5　熒光定量PCR

熒光定量PCR在ABI 7500熒光定量PCR儀中進行，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL， DNA模板8.8 μL，每個反應(yīng)設(shè)3個平行重復(fù)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s，60 ℃ 復(fù)性并延伸34 s，40個循環(huán)。隨后進行熔解曲線分析以確定引物的特異性，反應(yīng)程序為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，然后以0.1 ℃/s 的速率升溫至95 ℃， 進而形成一個熒光信號隨溫度升高而減弱的熔解曲線圖。

1.6　質(zhì)?？截悢?shù)測定標準曲線的的建立

利用超微量分光光度計One Drop OD-1000+測定質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2濃度，根據(jù)下面公式[22]計算其對應(yīng)拷貝數(shù)，然后10倍稀釋至108、107、106、105、104拷貝/μL，用作建立標準曲線時熒光定量PCR的反應(yīng)模板。

反應(yīng)結(jié)束后，以測得Ct值為縱坐標，拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標進行線性回歸分析，擴增效率(E)與標準曲線的斜率(k)相關(guān)[23]，計算公式為：

E=(10-1/k-1)×100%

1.7　質(zhì)?？截悢?shù)的計算

同時采用絕對定量和相對定量的方法對質(zhì)?？截悢?shù)進行計算，其中絕對定量參照Yu等[24]所述方法進行。相對定量中質(zhì)?？截悢?shù)的計算先按照Livak等[25]所述方法判斷-ΔΔCt方法對本研究數(shù)據(jù)處理的適用性，如不適用則參照Pfaffl等[26]所述方法進行質(zhì)?？截悢?shù)的計算，公式為：

式中，Etarget為靶基因的擴增效率；Erefere為參考基因的擴增效率；ΔCt target(control-sample)為參照樣品中靶基因Ct減去待測試樣品中靶基因Ct；ΔCt referet(control-sample)為參照樣品中參考基因Ct減去待測試樣品中參考基因Ct。

1.8　Geneaid DNA Mini Kit對染色體DNA和質(zhì)粒DNA的回收率測定

1.9　統(tǒng)計分析

利用Excel 2013進行數(shù)據(jù)分析，OriginPro 2016軟件對不同處理下得到的質(zhì)粒拷貝數(shù)進行單因素方差分析，P<0.05為存在顯著性差異，P<0.01為存在極顯著性差異，以均值±標準差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2　目的基因的PCR擴增Fig.2　PCR amplification of target genesM：DL2000 DNA Marker；1：orf1；2：luxS；3：orf2

對構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過引物M13-47/ M13-48進行PCR鑒定，可分別擴增出大小約為811 bp，1 310 bp和1 753 bp的預(yù)期目的片段(圖3)，進一步測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2。

2.2　引物特異性評價

引物的特異性通過PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線進行分析。電泳結(jié)果顯示，引物對qluxS-F/qluxS-R，qorf1-F/qorf1-R，qorf2-F/qorf2-R PCR對質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2和基因組總DNA的擴增產(chǎn)物分別為91 bp，83 bp和130 bp預(yù)期大小的單一條帶(圖4)。熔解曲線亦顯示3對引物的PCR產(chǎn)物均表現(xiàn)為單一峰，這表明在分析溫度范圍內(nèi)，沒有非特異性擴增。

圖3　構(gòu)建質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3　PCR identification for constructed plasmids M：DNA Marker DL-2000；1：pUC18-orf1；2：pUC18-luxS-orf1；3：pUC18-luxS-orf1-orf2

2.3　標準曲線的建立

在1×104～1×108拷貝/μL濃度范圍內(nèi)，以測得Ct值對模板拷貝數(shù)的對數(shù)值作圖，結(jié)果見圖5，可見所有曲線均呈線性相關(guān)(R2>0.999)，斜率分別為-3.285 15、-3.333 5和-3.396、與之相應(yīng)的擴增效率分別為101.6%、99.5%和 97.0%。熒光定量PCR要求R2>0.99，擴增效率介于90%～110%之間。本研究中，基于3對引物進行的熒光定量PCR均滿足條件，表明實驗結(jié)果可信。

圖4　熒光定量PCR產(chǎn)物電泳 Fig.4　Electrophoresis of real-time PCR products M：DL 2000 DNA Marker；1，3,5:以質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2為模板進行PCR擴增的luxS，orf1和orf2 產(chǎn)物；2,4,6：以　愛德華氏菌總基因組為模板進行PCR擴增的luxS，orf1和orf2產(chǎn)物

圖5　luxS(a)、orf1(b)和orf2(c)標準曲線的建立Fig.5　Construction of the standard curves for luxS (a)，orf1 (b) and orf2 (c)

2.4　ΔΔCt方法的適用性評價

ΔΔCt方法計算有效的前提條件為，目的基因和參考基因的擴增效率必須近似相等。為確認這一點，以不同模板稀釋度下目的基因與參考基因Ct值的差值ΔCt對模板拷貝數(shù)的對數(shù)進行繪圖，如回歸斜率趨近于零即可確認其有效性，而本研究中不同稀釋度下，目的基因orf1和orf2相對于參考基因luxS的ΔCt回歸斜率分別為-0.034 3(圖6a)和-0.145(圖6b)，這表明ΔΔCt方法適宜于前者而不宜用于后者的質(zhì)?？截悢?shù)計算。為保證計算的一致性，后續(xù)相對定量根據(jù)Pfaffl等[26]所述方法進行。

圖6　ΔΔCt計算的有效性Fig.6　Validation of the ΔΔCt calculation for orf1/luxS (a) and orf2/luxS (b)

2.5　質(zhì)粒拷貝數(shù)計算

絕對定量策略下，試劑盒提取的總DNA中，pEI1的拷貝數(shù)為3.63±0.30，pEI2的拷貝數(shù)為5.04±0.18，而水煮法制備的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)則分別為11.84±0.80 和11.70±0.25 (表2)，兩種不同總DNA制備方法下所測得質(zhì)?？截悢?shù)差異極顯著。

表2　絕對定量測得的質(zhì)?？截悢?shù)Tab.2　Estimated plasmid copy number (PCN) by absolute quantification

注：同一列數(shù)據(jù)上標中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

相對定量策略下，試劑盒提取的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)分別為4.22±0.15和5.13±0.50，而水煮法制備的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)則分別為13.85±1.64 和11.90±0.97(表3)，兩種不同總DNA制備方法下所測得質(zhì)?？截悢?shù)差異極顯著。

表3　相對定量測得的質(zhì)粒拷貝數(shù)Tab.3　Estimated plasmid copy number (PCN) by relative quantification

2.6　Geneaid DNA Mini Kit對染色體DNA和質(zhì)粒DNA的回收率

3　討論

在利用實時熒光定量PCR進行質(zhì)?？截悢?shù)測定時，主要有兩種定量策略：絕對定量和相對定量，絕對定量需構(gòu)建標準品及標準曲線，據(jù)此來推算未知樣本的量；而相對定量則只需確定樣本中靶序列相對于另一參照樣本的量的變化即可，根據(jù)不同的計算方法又可分為2-ΔΔCt法和Pfaffl法等[25，26]，其中前者要求目的基因與內(nèi)參基因擴增效率基本相等且接近于100%，在實驗中通常難以得到滿足，而后者則充分考慮了擴增效率對結(jié)果的影響，更具有可行性，結(jié)果也更為準確。在Lee等[27]對大腸桿菌質(zhì)粒拷貝數(shù)的測定中，基于2-ΔΔCt法的相對定量與絕對定量的計算結(jié)果基本一致。本研究中，由于針對luxS、orf1和orf2的引物擴增效率不完全一致，分別為101.6%、99.5%、97.0%，最終采用Pfaffl法進行相對定量，計算結(jié)果顯示，除水煮法組的pEI1拷貝數(shù)在兩種定量策略下存在差異之外(分別為11.84±0.80和13.85±1.64)，其余皆無顯著差異，這表明只要選擇合適的相對定量方法，其計算結(jié)果與絕對定量策略下的計算結(jié)果具有一致性。