張　旻，王　娜，景宏麗，吳紹強(qiáng)

(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100029)

草魚呼腸孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)，又稱草魚出血病病毒(grass carp hemorrhagic virus，GCHV)，屬呼腸孤病毒科(reoviridae)水生呼腸孤病毒屬[1]。目前已報道了GCRV的14種分離株，并在全基因測序的基礎(chǔ)上確立了2種基因型：以GCRV-873株為代表的Ⅰ型和以GCRV-108株為代表的Ⅱ型，二者核酸序列同源性只有50%左右[2]。GCRV-873株分離自湖南[3]，該病毒為雙鏈RNA病毒，基因組由11條dsRNA片段組成[4]，對草魚腎臟細(xì)胞系[5](grass carp kidney cell line，CIK)和草魚卵巢細(xì)胞系(grass carp ovarian cell line，CO)細(xì)胞系敏感[6，7]。已建立了針對GCRV-873株的病原分離[8]、ELISA[9]和RT-PCR檢測方法，并形成了技術(shù)規(guī)范[10]，應(yīng)用于疫病監(jiān)測。

為提高檢測效率，建立了一種GCRV-873株特異性的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification ,RT-LAMP)檢測方法。該方法檢測限可達(dá)10個拷貝數(shù)的目的基因，且不與鯉春病毒、傳染性造血器官壞死病病毒、傳染性胰臟壞死病毒和病毒性出血性敗血癥病毒RNA產(chǎn)生交叉反應(yīng)。在反應(yīng)體系中加入染料后，反應(yīng)結(jié)果肉眼直接可見，不需電泳即可判斷結(jié)果，避免了LAMP技術(shù)常見的氣溶膠污染。該方法是一種便捷高效、安全可靠的檢測方法，適合大批量樣品的現(xiàn)場初篩和實驗室檢測。

1　材料與方法

1.1　病毒株及病毒RNA

GCRV-873株由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供。GCRV-873株接種于CIK細(xì)胞，25 ℃恒溫培養(yǎng)。待出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，細(xì)胞大部分脫落后，反復(fù)凍融細(xì)胞液3次，再使用Trizol(Promega，USA)提取總RNA。

鯉春病毒(spring viraemia of carp virus，SVCV)RNA、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)RNA、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)RNA、病毒性出血性敗血癥病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)RNA均由深圳出入境檢驗檢疫局水生動物病重點實驗室提供。

1.2　引物的設(shè)計

以GCRV VP5(Genbank No:AF239175.1)基因序列保守片段(218 bp)為模板，使用在線軟件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html和DNastar primer select 設(shè)計出2對引物(表1)。引物由上海生工有限公司合成。

表1　根據(jù)GCRV VP5基因片段設(shè)計的RT-LAMP引物Tab.1　RT-LAMP primers used to amplify GCRV VP5 gene

1.3　RT-LAMP反應(yīng)體系

使用藍(lán)譜核糖核酸擴(kuò)增試劑盒(Lanpu Bio-tech，China)中的試劑配置反應(yīng)體系，體系為25 μL：RNA模板1 μL，2×反應(yīng)緩沖液(含MgSQ416 mmol/L，和dNTPs 2.8 mmol/ L each)12.5 μL，引物GCRV-FIP和GCRV-BIP (20 pmol/μL)各2 μL，引物GCRV-F和GCRV-B (10 pmol/μL)各0.5 μL，酶溶液(Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液)1 μL，去離子水5.5 μL。

1.4　RT-LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

以GCRV-873 RNA為模板，分別在58、60、62和65 ℃下進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。使用濁度儀LA-320C(Lanpu Bio-tech，China)讀取擴(kuò)展結(jié)果。

1.5　RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的克隆及陽性對照制備

使用TIANgel Midi Purification Kit (TIANGEN，China)膠回收試劑盒，回收純化引物GCRV-F和GCRV-B的PCR擴(kuò)增片段，再將片段連接入pGem-T-Esay 載體(Novigen)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白色菌落測序,若目的基因正確連接入重組質(zhì)粒，則提取陽性重組質(zhì)粒pGem-T-GCRV做為RT-LAMP檢測用陽性對照。使用微量紫外分光光度計對重組質(zhì)粒溶液進(jìn)行定量，并按照以下公式將重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度換算為拷貝數(shù)濃度：

(6.02×1023)×(濃度g/mL)/(MW g/moL)=copies/mL

1.6　RT-LAMP檢測方法的檢測限

根據(jù)測量和換算的濃度，將重組質(zhì)粒pGem-T-GCRV溶液稀釋為1011copies/μL的溶液，再將該溶液以10倍梯度稀釋至100、101、102、103、104、106、107copies/μL，每稀釋度各取1 μL分別進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，使用1.3的反應(yīng)體系和1.4確認(rèn)的反應(yīng)溫度。

1.7　RT-LAMP檢測方法與RT-PCR檢測方法的檢測限對比

根據(jù)現(xiàn)行的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3584-2013)，GCRV-873株RT-PCR檢測方法的目的基因為VP7基因片段，而本LAMP檢測VP5基因片段，因此無法使用同一種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測限比對，只能使用病毒RNA。將1.1提純的接種細(xì)胞總RNA(約100 ng/μL)10倍梯度稀釋，每個稀釋梯度各取1 μL作為模板，分別進(jìn)行RT-LAMP(反應(yīng)體系條件同1.6)和RT-PCR檢測(反應(yīng)體系和條件參照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3584-2013)，對比檢測限。

1.8　RT-LAMP檢測方法的交叉反應(yīng)

以GCRV-873株、SVCV、IHNV、IPNV和VHSV RNA為模板，各取1 μL分別進(jìn)行RT-LAMP檢測(反應(yīng)體系和溫度同1.6)。

1.9　RT-LAMP檢測結(jié)果的可視化

在1.3反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，加入0.5 μL calcein 染料，體系仍為25 μL。將PCR管放置于烘箱中，反應(yīng)溫度為1.4確認(rèn)的溫度，反應(yīng)時間為60 min。

1.10　病毒樣品檢測

本實驗室根據(jù)《草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3584-2013)推薦的病原分離和RT-PCR方法，檢測并保存了10份GCRV-873株陽性樣品和12份GCRV陰性樣品，利用建立的熒光RT-LAMP檢測方法進(jìn)行檢測，統(tǒng)計符合率。

2　結(jié)果與分析

2.1　RT-LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

62 ℃和65 ℃組反應(yīng)20 min出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，58 ℃和60 ℃組反應(yīng)26 min出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，反應(yīng)時間超過60 min，陰性對照會出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。為提高引物與模板結(jié)合的特異性，RT-LAMP的反應(yīng)條件確定為65 ℃恒溫反應(yīng)60 min(圖1)。

圖1　GCRV RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.1　The optimization of the reaction condition of RT-LAMP for GCRV N：陰性對照；1：58 ℃；2：60 ℃；3：62 ℃；4：65 ℃

2.2　RT-LAMP檢測方法的檢測限

反應(yīng)條件為65 ℃恒溫反應(yīng)60 min，隨著樣品模板量的遞減，RT-LAMP擴(kuò)增曲線出現(xiàn)的時間也逐漸延長，模板稀釋到10個拷貝數(shù)，PCR 擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性,模板稀釋到100，即1拷貝數(shù)時擴(kuò)增結(jié)果則為陰性。由此可得出RT-LAMP檢測限為10個拷貝數(shù)的目的基因核酸片段(圖2)。

圖2　RT-LAMP檢測限(拷貝數(shù))Fig.2　The detection limit of RT-LAMP (copies)N：陰性對照；0～7：重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的模板量分別為100 ～107 copies

2.3　RT-LAMP與RT-PCR的檢測限對比

原液稀釋104倍，總RNA量約10 pg，RT-LAMP結(jié)果仍為陽性；相比之下，RT-PCR只能檢測到稀釋103倍，總RNA量約1 pg的3號樣品(圖4)，而且條帶很淺。RT-LAMP檢測限比RT-PCR高10倍(圖3)。

圖3　RT-LAMP檢測限(RNA濃度)Fig.3　The detection limit of RT-LAMP (RNA concentration)

圖4　RT-PCR檢測限(RNA濃度)Fig.4　The detection limit of RT-PCR (RNA concentration)N：陰性對照；0：RNA原液；1～6：原液稀釋倍數(shù)分別為101～106 倍

2.4　RT-LAMP檢測方法的交叉反應(yīng)

交叉反應(yīng)只有 GCRV 873株呈陽性，而其他病毒則為陰性。建立的RT-LAMP檢測方法特異性良好(圖5)。

圖5　RT-LAMP交叉反應(yīng)檢測結(jié)果Fig.5　Cross reaction results of RT-LAMPN：陰性對照；1：GCRV-873株；2：SVCV；3：IHNV；4：IPNV；5：VHSV

2.5　RT-LAMP檢測結(jié)果的可視化

檢測結(jié)果顯示GCRV-873株呈綠色，其他樣品未變色(圖6)。

2.6　病毒樣品檢測

利用建立的RT-LAMP檢測方法對本實驗室保存的10份GCRV陽性樣品和12份GCRV陰性樣品的檢測結(jié)果與按照《草魚出血病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 3584-2013)檢測的結(jié)果一致，符合率100%。

3　討論

由于我國草魚養(yǎng)殖面積很大，在針對GCRV的檢測工作中，樣品量也非常大，有時一批樣品包括150尾魚。這導(dǎo)致檢測任務(wù)的工作量非常繁重。為減輕工作量、提高檢測效率，需要在保證檢測限和特異性的基礎(chǔ)上，建立比傳統(tǒng)的ELISA和RT-PCR方法更方便快捷的檢測方法。

圖6　熒光RT-LAMP檢測GCRV-873株Fig.6　Fluorescence RT-LAMP for detection of GCRV-873N：陰性對照；1：SVCV；2：IHNV；3：VHSV；4：GCRV-873株

LAMP技術(shù)的原理是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物,利用Bst DNA polymerase在恒溫條件下完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)[11]。LAMP技術(shù)的檢測限通常高于PCR方法，與熒光定量PCR方法相當(dāng)[12]。作為新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，近年來國內(nèi)外陸續(xù)建立了多種針對水產(chǎn)病毒的LAMP檢測方法，如皰疹病毒Ⅱ型[13]、傳染性造血組織壞死病毒[14]、真鯛虹彩病毒(RSIV)[15]等。

本研究建立的特異性檢測GCRV-873株的RT-LAMP檢測方法，將病原RNA的反轉(zhuǎn)錄與LAMP擴(kuò)增反應(yīng)集中于同一反應(yīng)體系，恒溫條件下一次性完成擴(kuò)增，相對于傳統(tǒng)的RT-PCR方法和ELISA方法，主要有以下兩點優(yōu)勢：1.耗時短:RT-PCR方法檢測GCRV，需要3 h左右，ELISA方法也需要5 h左右，該RT-LAMP方法省去了制備瓊脂糖凝膠、電泳等過程，反應(yīng)只需要60 min；2.檢測限比RT-PCR方法高10倍，因此該方法非常適合病原的臨床檢測。

目前國內(nèi)外也建立了其他幾種針對GCRV的RT-LAMP檢測方法，與本研究建立的RT-LAMP檢測方法的區(qū)別如下：(1)2013年，建立了針對GCRV-HZ08株(GCRV Ⅱ型)的RT-LAMP檢測方法[16]，而本研究建立的RT-LAMP方法是特異性檢測GCRV-873株(CCRV I型)的，兩種基因型的基因同源性只有50%，該方法能否檢測GCRV-873株的基因，尚未有報道；(2)2012年-2013年，先后報道了4種檢測GCRV VP6基因片段的RT-LAMP檢測方法，除其中1種未報道詳細(xì)數(shù)據(jù)外[17]，其他3種檢測限分別達(dá)到7 copies[18]、10 copies[19]和33 pg[20]的病毒RNA。但這3種方法主要利用電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，作為一種高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)，LAMP產(chǎn)物的目的基因含量極高，打開反應(yīng)管取樣的過程中有一定氣溶膠污染風(fēng)險[21]，容易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。本研究建立的RT-LAMP檢測技術(shù)，不需要打開反應(yīng)管，在封閉的環(huán)境中使用濁度儀或染料判斷檢測結(jié)果，極大降低了氣溶膠擴(kuò)散的風(fēng)險，可以有效避免核酸擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)假陽性[22]。

綜上所述，本研究建立的GCRV-873株RT-LAMP檢測方法，具備特異性強(qiáng)、檢測限高、耗時短、假陽性風(fēng)險低等優(yōu)點，適合大批量樣品的現(xiàn)場初篩和實驗室檢測。