單洪波 史佳文 石 瑛

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030

蛋白含量是馬鈴薯塊莖的重要品質(zhì)性狀, 也是重要的育種目標(biāo)之一[1]。張澤生等[2]對馬鈴薯蛋白的氨基酸組成深入研究證實, 塊莖內(nèi)含有較高的必需氨基酸, 占其總量的47.90%左右。潘牧等[3]研究表明, 馬鈴薯蛋白的第一限制氨基酸為色氨酸, 且富含其他糧食作物所缺乏的賴氨酸, 可與大豆蛋白等谷類蛋白互補。通過對動物與人類試驗證明, 馬鈴薯蛋白富有較高的生物價值[4-5]。因此, 馬鈴薯塊莖蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白, 營養(yǎng)價值極高, 高蛋白含量馬鈴薯品種的選育能夠提升馬鈴薯的營養(yǎng)價值。

傳統(tǒng)的馬鈴薯育種周期較長, 篩選效率較低, 并伴隨精確度低等諸多弊端, 分子標(biāo)記輔助選擇能極大地縮短育種年限, 提高育種效率。目前, 已有數(shù)十個馬鈴薯重要性狀被標(biāo)記, 例如抗病毒病、抗青枯病、抗晚疫病等抗病性狀[6-7]; 炸片顏色、薯肉顏色等品質(zhì)性狀[8]; 耐干旱、抗凍性等抗性性狀[9]。祁緣[10]通過BSA策略結(jié)合與QTL區(qū)域緊密連鎖的分子標(biāo)記DMC42144af、DMC42152bf, 將2個馬鈴薯晚疫病 AFLP標(biāo)記定位在第 9染色體上的一個QTL dPI09a置信區(qū)間內(nèi); 雷劍等[11]根據(jù) BSA混池方法開發(fā)了與馬鈴薯青枯病抗性緊密連鎖的SRAP標(biāo)記; Rak等[12]利用多倍體模型全基因組關(guān)聯(lián)分析將薯片顏色 QTL定位到第2染色體的短臂上; Tiwari等[13]將源于二倍體馬鈴薯中的BR基因分子標(biāo)記用于馬鈴薯抗晚疫病性狀的篩選, 但在四倍體馬鈴薯材料的實際應(yīng)用中, 復(fù)雜的遺傳方式使目的性狀與標(biāo)記分離, 并伴隨篩選準(zhǔn)確率低等諸多問題。有關(guān)塊莖蛋白含量的分子標(biāo)記研究較少, 鄔信康等[14]根據(jù)限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)和脈沖電泳分析, 表明馬鈴薯蛋白多基因簇位于第 8染色體的 1.4 Mb的DNA片段上。隨著BSA混池方法與測序技術(shù)的不斷成熟, 高篩選效率與精準(zhǔn)度得到了極大的保障, 能夠為分子輔助育種提供新的標(biāo)記資源。在四倍體水平上對馬鈴薯蛋白含量相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)與研究有利于加速馬鈴薯蛋白含量分子輔助育種進(jìn)程。

本研究以四倍體馬鈴薯蛋白含量分離群體為材料,利用BSA混池構(gòu)建與高通量簡化基因組測序相結(jié)合(以下簡稱BSA混池測序), 開發(fā)四倍體馬鈴薯蛋白含量的分子標(biāo)記, 并經(jīng)極端高蛋白、極端低蛋白群體材料及四倍體馬鈴薯品種的驗證, 獲得與四倍體馬鈴薯蛋白質(zhì)含量相關(guān)的分子標(biāo)記, 為分子輔助育種提供便利, 也為加快優(yōu)質(zhì)馬鈴薯品種的選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 F1代分離群體 以蛋白含量 2.32%的高蛋白品種大西洋為母本, 蛋白含量1.31%的低蛋白品種定薯1號為父本, 雜交獲得 173份 F1代分離群體, 以親本和 F1代分離群體作為開發(fā)蛋白含量分子標(biāo)記的試驗材料。

1.1.2 供試品種 選取54個四倍體馬鈴薯品種作為蛋白含量分子標(biāo)記的驗證材料(表1)。

表1 馬鈴薯品種信息Table1 Information of potato varietie s

1.2 分離群體及四倍體品種蛋白含量的測定

2016—2017年連續(xù) 2年將分離群體種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽農(nóng)場實驗基地, 每份材料種植7株, 于收獲期收獲材料, 選取每份材料3株進(jìn)行樣品處理。將粉碎并通過40～60目/寸網(wǎng)篩的試樣0.1 g置洗滌干凈且烘干的消化管中, 加入1 mL水和5 mL濃硫酸放置過夜。

將消化管放入通風(fēng)櫥中的消煮爐上, 設(shè)置溫度為400～450℃, 每隔 15 min加3～4滴催化劑過氧化氫。待樣品消化至澄清透明且無雜質(zhì), 取下放涼, 同時做空白試驗。

將消化好的樣品經(jīng)凱氏定氮儀檢測, 得到全氮含量,換算成蛋白含量。

1.3 DNA的提取與極端分離后代DNA混池的構(gòu)建

采用 CTAB法提取馬鈴薯材料基因組 DNA, 用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

分別構(gòu)建極端高蛋白含量和極端低蛋白含量后代的DNA混池, DNA的提取方法與質(zhì)量檢測方法同上。

1.4 標(biāo)記開發(fā)

建庫、簡化基因組測序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司幫助完成, 根據(jù)測序結(jié)果獲得了極端高蛋白與極端低蛋白混池間的差異片段, 參照馬鈴薯基因組序列網(wǎng)站(http://solanaceae.plantbiology.msuedu/pgsc_download.sht ml)對差異片段內(nèi)的差異標(biāo)簽的位點利用在線引物設(shè)計網(wǎng)站(http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)進(jìn)行引物的設(shè)計。將Tm值設(shè)定在55℃～60℃之間, 引物預(yù)擴增片段大小設(shè)定在400～900 bp之間。將設(shè)計好的引物送至博仕生物工程有限公司進(jìn)行合成。

以高蛋白馬鈴薯品種大西洋和低蛋白馬鈴薯品種定薯1號的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增, 選擇僅能在親本之一中擴增出條帶或者在雙親中擴增出不同條帶的引物用于開發(fā)SCAR標(biāo)記。最后對極端分離群體材料進(jìn)行標(biāo)記驗證。通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量與特異性檢測。PCR體系為20 μL, 含8.2 μL ddH2O、10 μLTaq-Plus PCR Forest Mix (2×)、0.4 μL 引物 F (10 μmol L–1)、0.4 μL 引物 R (10 μmol L–1)、1 μL DNA (100 ng μL–1)。PCR擴增條件設(shè)定為預(yù)變性95℃ 3 min; 變性95℃ 30 s, 退火58℃ 30 s, 延伸72℃ 50 s, 35個循環(huán); 終延伸72℃ 10 min。

1.5 標(biāo)記的檢測

分別以馬鈴薯F1代分離群體的74份高蛋白群體材料、42份低蛋白群體材料及54個四倍體馬鈴薯品種的基因組DNA作為模板, 以分子標(biāo)記SCAR8-107為引物進(jìn)行PCR擴增后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理

根據(jù)分子標(biāo)記檢驗結(jié)果, 將與高蛋白含量親本和低蛋白含量親本帶型一致的基因型分別記作1和0, 通過統(tǒng)計分析軟件SPSS的Pearson’s雙側(cè)檢驗對分子標(biāo)記檢測結(jié)果與蛋白含量的鑒定結(jié)果進(jìn)行雙側(cè)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量的測定

測量獲得蛋白含量大于2.0%的高蛋白材料74份, 蛋白含量小于1.5%的低蛋白材料42份以及介于1.5%～2.0%之間的中蛋白含量材料57份(表2); 經(jīng)對分離群體蛋白含量的測定得到了分離群體的蛋白含量分布圖, 可以看出極端材料較少, 中等蛋白含量材料較多, 并且曲線大致呈正態(tài)分布(圖1)。說明馬鈴薯蛋白含量為數(shù)量性狀。

圖1 群體蛋白含量分布Fig. 1 Distribution of group protein content

表2 群體蛋白含量的測定結(jié)果Table 2 Determination of group protein content

2.2 蛋白含量基因區(qū)段引物的設(shè)計與檢測

根據(jù)前期測序的結(jié)果, 在第 8染色體上 1.151～1.248 Mb區(qū)間內(nèi)得到了目的性狀的差異片段, 此片段與控制馬鈴薯高蛋白含量相關(guān)聯(lián), 區(qū)間大小在 97 kb,在該區(qū)段共設(shè)計引物34對(表3), 分別以高蛋白親本品種大西洋與低蛋白親本品種定薯1號的基因組DNA為模板對設(shè)計的引物進(jìn)行特異性檢測(圖 2)。在該區(qū)段設(shè)計的引物中, 引物8-107展現(xiàn)出在差異蛋白含量親本中的特異性, 即在高蛋白含量親本擴增有條帶, 低蛋白親本無擴增條帶。

表3 引物信息Table 3 Primer information

圖2 部分引物在親本定薯1號和大西洋的擴增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR products of some primers in parents Dingshu 1 and Atlantic

2.3 分子標(biāo)記的開發(fā)與驗證

將在雙親中擴增出差異條帶的引物, 通過 25份極端高蛋白與 25份極端低蛋白后代驗證發(fā)現(xiàn), 親本擴增出現(xiàn)差異的引物8-107在極端高蛋白與極端低蛋白后代中擴增結(jié)果一致。即引物8-107在極端高蛋白材料中的擴增結(jié)果與親本大西洋一致, 均擴增出條帶, 而引物 8-107在極端低蛋白材料中的擴增結(jié)果與親本定薯1號保持一致, 均未擴增出條帶(圖3)。因而, 本試驗中, 篩選的引物8-107被選取用于后續(xù)的實驗研究, 命名引物 8-107為SCAR8-107。

2.4 標(biāo)記SCAR8-107在分離群體高蛋白和低蛋白子代中的檢測

圖3 引物8-107標(biāo)記在部分極端高蛋白與極端低蛋白分離后代中的PCR擴增結(jié)果Fig. 3 PCR amplification results of primers 8-107 in partial extremely high protein and extremely low protein progenies

在四倍體馬鈴薯F1代的173份分離群體中, 存在74份高蛋白材料、42份低蛋白材料以及 57份中蛋白材料,以其中的74份高蛋白群體材料和42份低蛋白群體材料作為SCAR8-107標(biāo)記檢測的目的材料。在標(biāo)記為陽性的(有PCR擴增產(chǎn)物)的70份材料中有67份為高蛋白含量材料,分子標(biāo)記的檢測結(jié)果與表型的對應(yīng)度達(dá)到了 95.71%。在標(biāo)記為陰性的(無PCR擴增產(chǎn)物)的46份材料中有38份為低蛋白材料, 分子標(biāo)記的檢測結(jié)果與表型的對應(yīng)度達(dá)到了82.61%。共116份后代材料的分子標(biāo)記與蛋白含量表型鑒定的結(jié)果總體的對應(yīng)度達(dá)到了90.51% (圖4和表4)。將蛋白含量的測定結(jié)果與分子標(biāo)記的鑒定結(jié)果進(jìn)行SPSS雙側(cè)相關(guān)性分析, 相關(guān)系數(shù)(r)為0.794, 達(dá)到了極顯著水平。

2.5 標(biāo)記SCAR8-107在四倍體品種中的檢測

在54個馬鈴薯品種中, 蛋白含量大于2.0%的高蛋白含量的品種有10個, 占總材料的18.51%; 蛋白含量小于1.5%的低蛋白含量品種有20個, 占總材料的37.03% (表1)。利用開發(fā)的分子標(biāo)記SCAR8-107對54個馬鈴薯品種檢測表明, 在標(biāo)記為陽性的14個品種中, 有9個為高蛋白含量, 分子標(biāo)記的檢測結(jié)果與蛋白含量的對應(yīng)度達(dá)到了71.42%; 在標(biāo)記為陰性的23個品種中, 有17個為低蛋白含量, 分子標(biāo)記的檢測結(jié)果與蛋白含量的對應(yīng)度達(dá)到了73.91% (圖5和表5)。54個品種的標(biāo)記檢測結(jié)果和蛋白含量的測定結(jié)果的總體的對應(yīng)度達(dá)到了 72.97%。將分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與蛋白含量測定結(jié)果進(jìn)行SPSS雙側(cè)相關(guān)性分析, 相關(guān)系數(shù)(r)為0.694, 達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明, 分子標(biāo)記SCAR8-107能夠很好地篩選不同馬鈴薯品種的蛋白含量, 此標(biāo)記能應(yīng)用于馬鈴薯蛋白含量的分子標(biāo)記輔助育種。

圖4 SCAR8-107標(biāo)記在部分高蛋白(A)與低蛋白(B)分離后代中的PCR擴增結(jié)果Fig. 4 PCR amplification results of SCAR8-107 marks in partial high protein (A) and low protein (B) progenies

表4 F1群體部分樣品的蛋白含量表型鑒定與標(biāo)記檢測結(jié)果統(tǒng)計Table 4 Identification of phenotype for protein content and statistics of marker test results in partial samples of F1

表5 部分品種蛋白含量表型鑒定與標(biāo)記檢測結(jié)果統(tǒng)計Table 5 Identification of protein phenotype and statistics of marker test results in partial varieties

圖5 SCAR8-107標(biāo)記在部分高蛋白(A)與低蛋白(B)品種中的PCR擴增結(jié)果Fig. 5 PCR amplification results of SCAR8-107 marks in partial high protein (A) and low protein (B) varieties

3 討論

開發(fā)并獲得與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記是分子標(biāo)記輔助育種的重要基礎(chǔ), 隨著 AFLP、SSR、SRAP、RAPD等技術(shù)的發(fā)展, 分子標(biāo)記輔助育種的研究進(jìn)程也得到了極大的推動, Takagi等[15]采用當(dāng)?shù)仄贩N“Hitomebore”進(jìn)行 EMS誘變處理, 產(chǎn)生耐鹽性的突變體(hst1), 運用BSA策略與野生親本進(jìn)行全基因組重測序, 結(jié)合Mutmap分析法, 找到了水稻耐鹽基因(OSRR22), 僅用2年時間就培育出耐鹽性的水稻新品種; 路洪鳳等[16]采用 BSA混樣策略, 通過全基因組掃描SNP, 分析差異頻率, 檢測F2群體早花性狀的QTL, 找到了一個位于早花的QTL Ef1.1中的候選基因。由于四倍體馬鈴薯減數(shù)分裂的復(fù)雜性以及分子標(biāo)記輔助育種復(fù)雜程度與通量的雙重限制, 導(dǎo)致難以應(yīng)用于規(guī)模較大的分子標(biāo)記輔助育種。本研究利用 BSA混池測序的方法對四倍體馬鈴薯進(jìn)行了 SCAR標(biāo)記的開發(fā)與驗證。該技術(shù)能夠極大地避免片段大小選擇的過程,使標(biāo)簽在基因組中的分布更加均勻, 適用于四倍體馬鈴薯等遺傳性多樣、基因組復(fù)雜的染色體片段的挖掘與分子標(biāo)記的開發(fā)。BSA (Bluk Segregant Analysis)集群分離分析法是一種利用極端性狀進(jìn)行功能基因定位的方法, 比較群體在多態(tài)位點(SNP)的等位基因頻率(AF)是否具有顯著差異。因此, BSA混池測序的方法在技術(shù)層面上解決了四倍體馬鈴薯標(biāo)記開發(fā)困難的問題, 實用性、篩選效率及準(zhǔn)確性都極可靠, 對四倍體馬鈴薯遺傳育種研究和品種選育都有著重大意義。

分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)能極大地縮短育種年限并且提高育種中目的性狀的準(zhǔn)確性[17]。迄今為止, 抗晚疫病、熟性、抗病毒病、抗青枯病、薯型、炸片顏色、薯肉顏色等十幾個馬鈴薯重要性狀相繼被標(biāo)記[9,18-23]。但關(guān)于馬鈴薯蛋白質(zhì)含量緊密連鎖的標(biāo)記開發(fā)的報道極少, 因此, 四倍體馬鈴薯蛋白含量分子標(biāo)記的開發(fā)對于四倍體馬鈴薯分子輔助育種有著重要的意義。本研究開發(fā)的分子標(biāo)記SCAR8-107在四倍體馬鈴薯品種以及四倍體分離群體 F1代材料中 PCR檢測結(jié)果與蛋白含量的表型鑒定結(jié)果對應(yīng)度分別達(dá)到了72.97%和90.51%, 統(tǒng)計學(xué)上達(dá)到了極顯著水平, 分子標(biāo)記 SCAR8-107與馬鈴薯蛋白含量性狀緊密相關(guān), 可以很好地鑒別四倍體馬鈴薯分離群體子代及馬鈴薯品種的蛋白質(zhì)含量, 對其進(jìn)行蛋白含量的篩選與輔助選擇。另外, SCAR標(biāo)記在實際應(yīng)用中更簡單、有效、更穩(wěn)定, 可以快速穩(wěn)定的鑒定大量的馬鈴薯材料[23]。

分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性是分子輔助選擇的關(guān)鍵, 直接決定著育種的成敗[24]。本研究中, 分子標(biāo)記 SCAR8-107在四倍體分離群體與四倍體品種中有著極高的篩選率, 但是仍有小部分的分子標(biāo)記檢測結(jié)果與表型的鑒定結(jié)果不一致。存在少量的極端材料與對應(yīng)的親本擴增不一致, 推測這些極端單株為重組單株, 或因為參照二倍體馬鈴薯DM 序列而設(shè)計的引物, 存在檢測不完全準(zhǔn)確的問題; 其次由于馬鈴薯蛋白含量為數(shù)量性狀, 受許多的微效基因控制, 而這些微效基因也會影響標(biāo)記的關(guān)聯(lián)度, 本研究尚處前期階段, 只開發(fā)了一個準(zhǔn)確的分子標(biāo)記, 隨著后續(xù)研究的開展, 更多相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā), 分子標(biāo)記的檢測將更為精準(zhǔn)可靠。另外馬鈴薯蛋白質(zhì)的含量受組合×地點互作影響顯著[25], 地點的變化也可能導(dǎo)致馬鈴薯蛋白質(zhì)含量細(xì)微變化, 不同品種不同耕作區(qū)域內(nèi)在蛋白質(zhì)含量上也會產(chǎn)生一定差異。本研究所開發(fā)出的SCAR8-107標(biāo)記在用于檢測的過程中, 所展現(xiàn)出的微小準(zhǔn)確性的差異可能也受到此原因的影響。此外, 群體規(guī)模較小、氣候原因及表型測定時蛋白質(zhì)的損耗也有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響,因此, 要繼續(xù)利用多年多點田間種植馬鈴薯材料進(jìn)行蛋白含量分子標(biāo)記的開發(fā), 在運用分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇時, 要同時選用多個與蛋白含量緊密連鎖的分子標(biāo)記同步選擇, 結(jié)果將更為精確可靠。

更正：發(fā)表于本刊 2018, 44(6): 852–858，艾麗娟等 “大豆籽粒硬實加性和上位性 QTL定位”一文中的圖 3更正為：

圖3 檢測到的加性QTL及上位性互作QTL在連鎖群上的分布Fig. 3 Location of additive QTLs and epistatic effects QTLs on linkage groups