張佳斌，張雪芳，李利君,2，肖　瓊,3,4，翁惠芬,3,4，倪　輝,2,3，肖安風(fēng),2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；4.廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建 廈門 361021)

0　引言

豆粕是大豆提取豆油后的殘渣經(jīng)加工得到的副產(chǎn)品[1]。豆粕與花生、菜粕等植物源性的蛋白源相比，具有營養(yǎng)成分均勻、消化利用率高、適口性好等優(yōu)點；與骨肉粉動物源性蛋白源相比，具有抗氧化強、安全系數(shù)高和貨源充足等優(yōu)勢[2-4]。因此，豆粕作為一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白飼料源，在畜禽飼料業(yè)中具有廣泛的使用價值[5]。

豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子包括大豆抗原蛋白、大豆寡糖、植酸和胰蛋白酶抑制因子等，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子限制了豆粕中有效成分在動物體內(nèi)的消化與利用[6-7]。研究表明[8-14]，豆粕在可控制條件下經(jīng)過微生物發(fā)酵處理，不僅對抗?fàn)I養(yǎng)因子有降解作用，還可以把大分子蛋白質(zhì)和碳水化合物降解成利于動物消化吸收的多肽類和糖類，并且富含活性益生菌、有機酸、消化酶以及生物活性因子等多種有益代謝產(chǎn)物，更有利于動物的消化吸收。

微生物發(fā)酵豆粕，降解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子是發(fā)酵的目的之一，關(guān)鍵是通過微生物發(fā)酵提高豆粕的營養(yǎng)價值和擴大豆粕的使用范圍?，F(xiàn)在國內(nèi)已有企業(yè)在生產(chǎn)發(fā)酵豆粕，但由于生產(chǎn)工藝不同，生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕的品質(zhì)差異較大[15]。目前，微生物發(fā)酵豆粕的研究往往著重于單純的抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除，而關(guān)于如何在有效去除抗?fàn)I養(yǎng)因子的基礎(chǔ)上，改善豆粕的飼用品質(zhì)，提高豆粕的利用率的研究較少。針對目前存在的這些問題，本試驗分別利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、乳酸菌(Lactobacillus)、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisae)3種益生菌，對豆粕進行微生物固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究不同菌種和發(fā)酵條件對豆粕營養(yǎng)成分的影響，為更好地開發(fā)和利用豆粕這種優(yōu)質(zhì)植物蛋白源提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

豆粕，廈門夏商淘化大同食品有限公司。

1.2　菌種

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、釀酒酵母(S.cerevisae)均為本實驗室保藏菌種；德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)20243、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)21718由菌種保藏中心提供，在本文中將二者合稱為乳酸菌(Lactobacillus)。

1.3　發(fā)酵菌液的制備

將枯草芽孢桿菌接種于MNB液體培養(yǎng)基中，置于180 r/min搖床，37 ℃ 培養(yǎng)12 h；釀酒酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置于180 r/min搖床，25 ℃培養(yǎng)24 h；乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，控溫42 ℃，靜置厭氧培養(yǎng)48 h。

1.4　豆粕固態(tài)發(fā)酵

將豆粕分裝于250 mL三角瓶中滅菌(121 ℃、高壓滅菌20 min)，冷卻備用。按一定接種量將種子液接入滅菌后的三角瓶中，加無菌水并攪拌均勻后靜置培養(yǎng)，自然pH值。發(fā)酵結(jié)束后收集樣品，60 ℃烘干、粉碎后密封保藏于-20 ℃冰柜中用于檢測指標(biāo)的測定。

1.5　豆粕單菌株發(fā)酵單因素試驗設(shè)計

將豆粕、無菌水、菌液(其中乳酸菌菌液中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌各占50%)配制后置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵48 h，以發(fā)酵溫度、料水比、接種量為變量設(shè)計單因素實驗，篩選得到最優(yōu)條件后，將發(fā)酵時間設(shè)為變量，在動態(tài)發(fā)酵過程中研究其發(fā)酵效果。

1.6　感官評價

參照國標(biāo)GB 21172—2007[16]和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 2218—2012[17]的規(guī)定以及陳萱等[18]使用的感官分析方法并有所改進：設(shè)定在光線正常及無異味的條件下，將適量樣品倒入干凈的玻璃容器中，通過目測、鼻嗅、手感分別評定樣品的顏色、氣味和質(zhì)地，具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1　發(fā)酵豆粕感官評價標(biāo)準(zhǔn)表

1.7　粗蛋白含量測定

按照徐佳璐等[19]和國標(biāo)GB/T 6432—1994[20]飼料中粗蛋白測定方法進行測定。

1.8　發(fā)酵豆粕pH值

取各個發(fā)酵點的發(fā)酵豆粕樣品l.0 g，加蒸餾水50 mL，于搖床上(180 r/min)振蕩20 min，過濾，測上清液pH值。

1.9　物料回收率

參照文獻(xiàn)[21]，準(zhǔn)確稱量發(fā)酵前后物料質(zhì)量，發(fā)酵豆粕的物料質(zhì)量與原料的物質(zhì)質(zhì)量的比值，即為物料回收率，公式為：F=mFSBM/mSBM×100，其中，F(xiàn)為物料回收率(%)；mFSBM為發(fā)酵豆粕的質(zhì)量(g)；mSBM為豆粕原料質(zhì)量(g)。

2　結(jié)果與分析

2.1　枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕條件的優(yōu)化

2.1.1溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的影響

溫度的高低影響著微生物菌株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力和代謝產(chǎn)物的分泌和運輸速率，直接關(guān)系到發(fā)酵豆粕品質(zhì)的優(yōu)劣[22]。由圖1可見，以發(fā)酵后豆粕的感官評價為主，豆粕在37 ℃發(fā)酵時，發(fā)酵豆粕呈褐色，醇香氣味濃郁，質(zhì)地偏柔軟黏稠，綜合感官評價效果最佳。以發(fā)酵后豆粕粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為輔，在所控條件下，發(fā)酵豆粕的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低，在發(fā)酵溫度為37 ℃時達(dá)到最高，達(dá)到59.60%，且鑒于芽孢桿菌抗逆性強和穩(wěn)定的性能，低溫狀態(tài)31 ℃時粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也比原料高出7.4%。再綜合pH值和物料回收率，選擇最適發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.1.2料水比對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的影響

基質(zhì)含水量影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧氣供應(yīng)、氣體流動等，是關(guān)系到發(fā)酵成敗的制約因素[23]?？莶菅挎邨U菌是好氧細(xì)菌，培養(yǎng)基中的水分過低會導(dǎo)致氧氣不足，營養(yǎng)也未能全部溶于水分中，利用率低，而水分太多會導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，不利于物料內(nèi)熱量的散發(fā)和氧氣的傳遞，影響菌的生長和繁殖[24]。當(dāng)料水比(m/V)為1∶1時，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)54.17%(見圖2a)，豆粕感官評價較為突出(見圖2b)，并且物料回收率在90.72%，可以帶來可觀的經(jīng)濟收益，故最適料水比定為1∶1。

2.1.3接種量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的影響

接種量適中利于枯草芽孢桿菌的生長與繁殖，利于產(chǎn)生蛋白酶，可以更好地進行發(fā)酵[26]。由圖3可知，發(fā)酵產(chǎn)物感官指標(biāo)沒有明顯差異，豆粕均呈褐色，有濃郁的醇香味，黏度高；在接種量為5%時，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到55.45%，其pH值與物料回收率較為穩(wěn)定，故選擇5%為最適接種量。

2.2　釀酒酵母菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1溫度對釀酒酵母菌發(fā)酵豆粕的影響

過高的溫度不利于釀酒酵母的生長，達(dá)不到提高發(fā)酵豆粕品質(zhì)的效果[24]。由圖4可見，在34、37 ℃兩個過高溫度條件下，釀酒酵母菌發(fā)酵豆粕的品質(zhì)迅速下降，其感官、pH值和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)都接近于未發(fā)酵豆粕指標(biāo)；而在25～31 ℃適宜溫度范圍內(nèi)，豆粕感官方面表現(xiàn)為深黃色，有酵母酒香味，質(zhì)地也較好。由于微生物作用產(chǎn)酸使pH值下降，更符合畜禽動物偏酸性的胃腸道環(huán)境，增加了適口性和良好風(fēng)味。粗蛋白含量增加，較高溫發(fā)酵時物料回收率稍有下降，均保持在86.23%，故選擇31 ℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2.2料水比對釀酒酵母菌發(fā)酵豆粕的影響

從圖5中各項指標(biāo)來看，料水比不是影響釀酒酵母發(fā)酵豆粕的主要因素。在適宜的發(fā)酵溫度、時間和接種量條件下，物料水分不論高低(1∶0.6～1∶1.4)都有良好的感官效果、適宜的酸度及物料回收率，更重要的是粗蛋白含量較穩(wěn)定。此條件下釀酒酵母能分泌多種水解酶類，利用豆粕作為氮源，發(fā)揮微生物的作用效果，提高蛋白質(zhì)的利用率[27]。為保證發(fā)酵效果，料水比定為1∶1。

2.2.3接種量對釀酒酵母菌發(fā)酵豆粕的影響

由圖6可知，發(fā)酵豆粕的氣味和質(zhì)地評價在接種量偏少或偏多的情況下較差；酵母菌接種量對于粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響較大，在接種量為5%時，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到52.69%，其pH值較為穩(wěn)定。接種量過多會造成微生物對營養(yǎng)的惡性競爭，過少則在固定時間內(nèi)微生物種群增長不足。為穩(wěn)定發(fā)酵，選擇5%為最優(yōu)接種量。

2.3　乳酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1溫度對乳酸菌發(fā)酵豆粕的影響

由圖7可得，乳酸菌發(fā)酵豆粕的感官效果、物料回收率和粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化都不明顯。乳酸菌能利用基質(zhì)中的多糖產(chǎn)生大量有機酸，從而使物料的pH值降低；乳酸菌在較寬溫度范圍(20～43 ℃)均可生長，較適宜的生長溫度是30～40 ℃，且分泌的酶系需要在適宜溫度下才能發(fā)揮最強的酶活力，調(diào)控微生物的新陳代謝和營養(yǎng)品質(zhì)的改善。這與上述實驗結(jié)果的分析基本一致，故將37 ℃定為最適發(fā)酵溫度。

2.3.2料水比對乳酸菌發(fā)酵豆粕的影響

水分含量是影響豆粕固態(tài)發(fā)酵質(zhì)量的重要因素，包被在豆粕表面的水膜能溶解微生物所需的無機鹽和代謝產(chǎn)物，同時為微生物的生長提供所需的潮濕環(huán)境[27]。乳酸菌是厭氧菌，水分含量高，物料粘連，溶氧量減少，適合乳酸菌發(fā)酵。由圖8可見，不同料水比條件下，豆粕呈現(xiàn)酸性，適于飼料的適口性，但含水量過高會增加發(fā)酵后期的干燥成本，料水比為1∶1.2時其粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)47%。因此，發(fā)酵豆粕過程中料水比定為1∶1.2。

2.3.3接種量對乳酸菌發(fā)酵豆粕的影響

分析圖9a中pH值、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)2個指標(biāo)可知，乳酸菌不同接種量使得發(fā)酵豆粕的含酸量、蛋白酶作用效果趨于穩(wěn)定；乳酸菌主要是利用碳水化合物通過生成的淀粉酶、纖維素酶等作用產(chǎn)酸及其他風(fēng)味物質(zhì)，而分泌的蛋白酶系比較少。因此，對豆粕中豐富的蛋白質(zhì)氮源不能充分利用，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就無法顯著提高，粗蛋白含量較低僅為47%，故選擇5%為最優(yōu)接種量。

2.4　單菌動態(tài)發(fā)酵過程的分析

在篩選最優(yōu)發(fā)酵條件下，研究枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和乳酸菌在動態(tài)發(fā)酵過程中對發(fā)酵豆粕的效果變化，結(jié)果見圖10。由圖10得到：在最優(yōu)條件下，不同時間內(nèi)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的總體感官指標(biāo)優(yōu)于釀酒酵母菌和乳酸菌，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后豆粕呈偏酸性的醬香味，感官良好；以釀酒酵母作為優(yōu)勢菌發(fā)酵后豆粕具有濃郁的酵母香；以乳酸菌作為優(yōu)勢菌發(fā)酵后豆粕具有濃郁的酸香味，呈低酸性，提高了動物飼料的適口性和誘食性。不同益生菌因發(fā)酵產(chǎn)生不同酶系，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌在發(fā)酵60 h后pH值開始下降且跨度較大。究其原因為：在發(fā)酵中產(chǎn)生中性蛋白酶和堿性蛋白酶且酶活力較為強盛，發(fā)酵豆粕由弱酸性轉(zhuǎn)變?yōu)閴A性(pH=8.3)；酵母菌在整個發(fā)酵過程中pH值變化范圍較小呈偏弱酸性。乳酸菌在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生大量有機酸如乳酸、乙酸和丙酸等，且時間越長作用越明顯，這是導(dǎo)致其pH值下降的主要因素。不同益生菌在發(fā)酵過程中，物料回收率隨著時間的增加而下降，張艷萍等[28]利用糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母及枯草芽孢桿菌對豆粕進行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料微生物活性越高，干物質(zhì)回收率越低，可知枯草芽孢桿菌生物活性較高，且粗蛋白含量較高，作為發(fā)酵菌株可以較大程度地保證生產(chǎn)效益。

3　結(jié)論

以枯草芽孢桿菌作為單一菌種發(fā)酵豆粕最優(yōu)發(fā)酵條件：料水比(m/V)為1∶1，接種量為5%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為48 h，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)62.3%；以釀酒酵母菌作為單一菌種發(fā)酵豆粕最優(yōu)發(fā)酵條件：料水比(m/V)為1∶1，接種量為5%，發(fā)酵溫度為31 ℃，發(fā)酵時間為60 h，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)53.8%；以乳酸菌作為單一菌種發(fā)酵豆粕最優(yōu)發(fā)酵條件：料水比(m/V)為1∶1.2，接種量為5%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為72 h，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)48.6%。本實驗利用不同益生菌經(jīng)試驗，得到的豆粕品質(zhì)雖存在差異，但都改善了豆粕的品質(zhì)。綜合考慮物料回收率因素，選擇枯草芽孢桿菌為最優(yōu)發(fā)酵益生菌。