李 黎，楊鵬郅，柯善文，鐘天秀,2，陳 曙,2，解新明,2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2.廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

Chen ShuE-mail:shuchen@scau.edu.cn

柱花草(Stylosanthesguianensis)是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)分布較為廣泛，且具有耐干旱、耐酸鋁、抗炭疽病，營養(yǎng)豐富、適口性好、產(chǎn)量高等特點的優(yōu)良豆科牧草[1-2]。同時柱花草也廣泛應(yīng)用于天然草地改良、果草生態(tài)建設(shè)及水土流失治理和退耕還林還草等各大領(lǐng)域[3]。但是大部分柱花草品種不耐寒冷，對低溫十分敏感，在我國南方冬季難以存活，更難以在北方得到廣泛推廣種植[4]。細莖柱花草(S.guianensisvar.intermedia)是一種多年生優(yōu)良豆科牧草，是柱花草的一個變種，1948年從美國引入澳大利亞(Gayndah和Brian地區(qū))進行栽培，我國華南地區(qū)20世紀60年代從澳洲引進種植，國人常將其翻譯為“奧茨利”或“奧克雷”，該變種具有較好的抗低溫、耐酸和耐低肥等特點，在廣東韶關(guān)地區(qū)可安全過冬長達40多年[5]。有研究對細莖柱花草轉(zhuǎn)錄組進行測序，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下細莖柱花草中轉(zhuǎn)錄因子SgNAC1和SgNAC2能較早地響應(yīng)低溫，而SgGH3可能受其他基因的調(diào)控，在后期表達[6]。劉攀道等[7]發(fā)現(xiàn)磷高效基因型TPRC2001-1的根部酸性磷酸酶活性顯著高于磷低效基因細莖柱花草。細莖柱花草對低溫脅迫有一定的適應(yīng)能力，但對其適應(yīng)低溫脅迫的主要生理機制鮮有報道。因此，研究細莖柱花草抗寒性的生理機制甚為重要，可以為今后的抗寒育種工程提供重要的研究基礎(chǔ)。

植物的生長發(fā)育會受到環(huán)境因子的影響，低溫是限制植物生長發(fā)育的環(huán)境因子之一。植物在受低溫影響后幾個小時，最多1 d即可表現(xiàn)出癥狀。低溫不僅會使植物生長停滯，還會造成植物減產(chǎn)，嚴重時導(dǎo)致植物死亡[8]。生物膜系統(tǒng)是冷害作用的首要作用部位[9]，膜的外形和厚度一旦發(fā)生變化，膜上會產(chǎn)生皸裂，因而膜的透性增大，離子大量外滲，電導(dǎo)率上升[10]，導(dǎo)致代謝不平衡，合成能力降低，分解加速，最終導(dǎo)致細胞死亡。同時，低溫脅迫下植物體內(nèi)活性氧自由基積累，細胞膜脂過氧化，導(dǎo)致丙二醛含量上升[11]。植物在低溫環(huán)境下，會通過積累相關(guān)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來降低、阻止或修復(fù)低溫造成的傷害，使其仍保持正常的生理活動[12]。脯氨酸作為低溫脅迫后的能源物質(zhì)能有效清除活性氧，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)的活性[8]。可溶性糖能夠增加細胞液濃度，提高細胞的保水能力，降低細胞冰點，減少脅迫對植物傷害[13]?？扇苄缘鞍鬃鳛橛H水性較強的物質(zhì)，可以束縛較多的水分，在低溫下減少細胞死亡的機率，從而提高植物的抗寒能力[13]。

本研究以細莖柱花草為材料，探討葉片在低溫脅迫下，相對電導(dǎo)率、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等抗寒性相關(guān)的生理指標的變化，旨在檢測細莖柱花草的抗寒性，以期對今后選育抗寒性強的柱花草品種提供鑒定參考。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

試驗對象為細莖柱花草，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系引種園(113°28 N；23°12 E)，對照為柱花草TPRC2001-1，其種子取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院根系生物學(xué)研究中心。

1.2　試驗設(shè)計

在兩種處于營養(yǎng)期的柱花草種質(zhì)資源植株上剪下枝條扦插于盆中，每個品種10盆，每盆2株，于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系溫室中正常生長。60 d后，將其置于4 ℃冷庫中進行低溫處理，分別于0 h(低溫處理前)，24 h和48 h后取相同部位的葉片測定其相對電導(dǎo)率，每個處理3個重復(fù)。測定其余生理指標的葉片迅速放于液氮中至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　指標測定及方法

參照測量相對電導(dǎo)率的方法[14]，用電導(dǎo)儀(上海雷磁新涇儀器有限公司DDS-11A)檢測溶液電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸法[15]測定丙二醛(malonaldehyde，MDA)(FW)含量；茚三酮比色法[16]測定脯氨酸含量(FW)；蒽酮顯色法[17]測定可溶性糖的含量(FW)；考馬斯亮藍比色法[17]測定可溶性蛋白含量的(FW)。每個指標數(shù)據(jù)均 3 次重復(fù)。

1.4　數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，對不同低溫時間處理進行單因素方差分析，并用Tukey法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較；采用Excel 2007制圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　低溫脅迫對細莖柱花草質(zhì)膜相對透性的影響

2.1.1相對電導(dǎo)率的變化細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草的相對電導(dǎo)率隨處理時間的增加而升高，且相對電導(dǎo)率表現(xiàn)為TPRC2001-1柱花草>細莖柱花草(圖1A)。在低溫處理前，兩種柱花草的相對電導(dǎo)率無顯著差異(P>0.05)，處理24 h后，兩種柱花草的相對電導(dǎo)率開始顯著上升，說明此時柱花草細胞膜開始受損，且TPRC2001-1柱花草的相對電導(dǎo)率顯著高于細莖柱花草(P<0.05)。在低溫處理48 h下，TPRC2001-1柱花草的相對電導(dǎo)率達到了44.52%，顯著高于細莖柱花草的21.23%(P<0.05)；同時，處理48 h的細莖柱花草的相對電導(dǎo)率還顯著低于低溫處理后24 h的TPRC2001-1柱花草的相對電導(dǎo)率(P<0.05)，說明低溫處理時間越長，柱花草葉片受損傷越嚴重，細莖柱花草細胞膜受損程度相對TPRC2001-1柱花草小。

2.1.2丙二醛含量的變化兩種柱花草低溫脅迫后丙二醛濃度隨著低溫脅迫時間的增加均表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，這說明隨著低溫處理時間的增加，柱花草細胞膜的膜脂過氧化反應(yīng)加強，造成丙二醛的過量積累(圖1B)。低溫處理前，細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草的丙二醛含量無顯著差異，分別為0.81和0.76 μmol·g-1(P>0.05)。低溫處理后，兩種柱花草的丙二醛含量上升，在低溫處理24 h和48 h后，細莖柱花草的丙二醛含量顯著低于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)；但處理48 h后的細莖柱花草與處理24 h 后TPRC2001-1柱花草的丙二醛含量無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明低溫導(dǎo)致細胞膜受到脂質(zhì)過氧化損傷，且品種間受損傷程度不同；在相同低溫處理條件下，相對TPRC2001-1柱花草而言，細莖柱花草受損傷程度較小。

2.2　低溫脅迫對細莖柱花草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.2.1脯氨酸含量的變化脯氨酸對逆境脅迫有一定的保護作用，它能防止細胞失水，保護大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。隨著低溫處理時間的延長，兩種柱花草的游離脯氨酸含量持續(xù)上升(圖2A)。低溫處理前，細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草的游離脯氨酸含量無顯著差異(P>0.05)，含量分別為6.40和6.72 μg·g-1；處理24 h后，兩種柱花草的脯氨酸上升，且細莖柱花草的脯氨酸顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)；處理48 h后，細莖柱花草游離脯氨酸的含量達到了處理前的4.31倍，為27.61 μg·g-1，顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)，表明細莖柱花草能夠積累更多脯氨酸以防止植物體脫水，細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性較好。

2.2.2可溶性糖含量的變化在低溫脅迫下植物體內(nèi)的糖含量增高，糖的積累能提高胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，增強持水力，使之在低溫下更難結(jié)冰[18]，降低低溫脅迫對細胞的傷害。隨著低溫處理時間的延長，兩種柱花草的可溶性糖含量持續(xù)上升(圖2B)。低溫處理前，細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草的可溶性糖含量無顯著差異(P>0.05)，含量分別為5.12和4.93mg·g-1；處理后，兩種柱花草的可溶性糖含量上升，低溫處理24 h后，細莖柱花草的可溶性糖顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)；處理48 h后，細莖柱花草可溶性糖含量達到了17.61 mg·g-1，顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)，表明細莖柱花草可積累更多糖來增加細胞的滲透濃度，細胞的保水能力強于TPRC2001-1柱花草。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level;similarly for Fig. 2.

圖2　低溫脅迫對細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草脯氨酸、可溶性糖、可溶蛋白含量的影響Fig. 2　Influence of low temperature stress on the proline, soluble sugar and soluble protein content of Stylosanthes guianensis var. intermedia and S. guianensis ‘TPRC2001-1’

2.2.3可溶性蛋白含量的變化植物在低溫脅迫下通過增加可溶性蛋白的含量來提高抗寒性。隨著低溫處理時間的增加，兩種柱花草的可溶性蛋白含量持續(xù)上升。低溫處理前，細莖柱花草和TPRC2001-1柱花草的可溶性蛋白含量無顯著差異(P>0.05)，含量分為5.54和5.84 mg·g-1；處理24 h后，兩種柱花草的可溶性蛋白上升，細莖柱花草的可溶性蛋白含量顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)；處理48 h后，細莖柱花草可溶性蛋白的含量達到了處理前的2.67倍，顯著高于TPRC2001-1柱花草(P<0.05)，表明可溶性蛋白的含量與柱花草抗寒性相關(guān)，且細莖柱花草在低溫脅迫下積累更多的可溶性蛋白(圖2C)。

3　討論

3.1　質(zhì)膜透性與抗寒性的關(guān)系

當植物遭受低溫脅迫時，植物中最先受傷害的部位是細胞膜，細胞膜破損導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲，水分流失，外滲的電解質(zhì)大小可以用相對電導(dǎo)率反映[19]。本研究中，低溫處理后細莖柱花草與TPRC2001-1柱花草的相對電導(dǎo)率迅速增加，且兩者存在明顯差異，細莖柱花草的相對電導(dǎo)率增加較小，相對電導(dǎo)率的大小變化與抗寒性成負相關(guān)。董琛等[8]在研究24份柱花草資源的抗冷性評價中發(fā)現(xiàn)冷處理后，相對電導(dǎo)率隨時間的增加而增加，且在處理1 d后，不同柱花草種質(zhì)間的相對電導(dǎo)率差異顯著，5 d后種質(zhì)間的差異更大，其中熱引18號柱花草、品109柱花草、馬弓形柱花草和粵研1號柱花草電導(dǎo)率值低，抗冷性較強。這與本研究的結(jié)果相似，說明細莖柱花草較TPRC2001-1柱花草的抗寒性較強。

在低溫鍛煉期間，植物細胞會積累過多的活性氧自由基，這些物質(zhì)會引起細胞膜脂過氧化反應(yīng)，而丙二醛則為該反應(yīng)的終端產(chǎn)物[20]。對馬鈴薯(Solanumtuberosum)抗寒性研究表明，在低溫脅迫條件下，品種間丙二醛的含量差異顯著，抗寒品種中丙二醛含量增加較小，且丙二醛的含量變化與抗寒性呈負相關(guān)關(guān)系[21]。本研究中，低溫處理后，兩種柱花草的MDA含量隨著時間的推移不斷上升，且品種間差異顯著。在低溫處理24和48 h細莖柱花草的MDA含量顯著低于同處理TPRC2001-1柱花草的含量，表明細莖柱花草相對TPRC2001-1柱花草是抗寒能力較強的品種。

3.2　滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與耐寒性的關(guān)系

脯氨酸是植物體內(nèi)能有效調(diào)節(jié)滲透能力的重要物質(zhì)之一[22]，它不僅能夠通過增強蛋白質(zhì)水合作用來提高植物的保水能力，而且還能保持細胞中酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低細胞損傷[23]。本研究中，低溫處理后的游離脯氨酸含量迅速增加，且細莖柱花草與TPRC2001-1柱花草存在明顯差異，細莖柱花草的游離脯氨酸含量增加較多。脯氨酸的大小變化與抗寒性呈正相關(guān)關(guān)系，通過脯氨酸含量測定比較10種宿根花卉抗寒性發(fā)現(xiàn)，低溫處理后不同品種脯氨酸含量變化的幅度不同，抗寒性強的馬藺(Irislacteavar.chinensis)、紫萼(Hostaventricosa)、大花飛燕草(Delphiniumgrandiflorum)品種其脯氨酸總體的變化幅度較大[24]。這與本研究細莖柱花草表現(xiàn)一致，說明細莖柱花草的抗寒性較好。

糖是植物生長過程中重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)[25]。在逆境中，植物會通過增加可溶性糖含量來提高自身的抵抗力?？扇苄蕴悄苷{(diào)節(jié)細胞滲透壓來增大細胞的保水能力，防止其遭受低溫而凝固，以增強植物耐寒性[26]。前人研究表明，在低溫脅迫條件下，品種間可溶性糖的含量差異顯著，抗寒品種中可溶性糖含量增加較多，且可溶性糖的含量變化與抗寒性呈正相關(guān)關(guān)系[27]。在本研究中，低溫處理24和48 h的細莖柱花草的可溶性糖含量增加較同處理的TPRC2001-1柱花草顯著增加，表明細莖柱花草的抗寒性強于TPRC2001-1柱花草。

可溶性蛋白是一類親水性的、能束縛水分的高分子化合物，能降低因在低溫下結(jié)冰而傷害致死的機率[28]。高京草等[29]對不同抗寒性棗樹品種枝條中可溶性蛋白含量的測定結(jié)果表明，抗寒性強的木棗品種可溶性蛋白含量高，抗寒性弱的晉棗品種可溶性蛋白質(zhì)含量較低。本研究中也得出相同的結(jié)果，兩種柱花草的可溶性蛋白含量在處理后迅速上升，品種間差異顯著，TPRC2001-1柱花草顯著低于細莖柱花草。說明細莖柱花草是抗寒性較強的柱花草品種。

許多研究表明，植物的抗寒機制是一個極其復(fù)雜的生理生化的過程，涉及多種物質(zhì)共同作用，單一的抗寒指標不能全面反映植物對冷脅迫的適應(yīng)力[30]。植物的抗寒性評價受多種不同抗寒指標的綜合影響。本研究中，綜合相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白各項生理指標，得到細莖柱花草的抗寒性強于TPRC2001-1柱花草。

4　結(jié)論

隨著低溫處理時間的增加，兩個品種柱花草葉片中的相對電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著增加，但兩個品種各項指標的變化幅度有所不同。在4 ℃低溫相同時間處理條件下，細莖柱花草的各項抗寒性生理指標均優(yōu)于TPRC2001-1柱花草，說明細莖柱花草具有較強抗寒性，可作為一種抗寒品種加以開發(fā)、研究和利用。