丁西朋，羅小燕，張龍，王文強(qiáng)，白昌軍

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

柱花草種間親緣關(guān)系SSR分析

丁西朋，羅小燕，張龍，王文強(qiáng)，白昌軍

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

為研究柱花草(Stylosanthesspp.)種間的親緣關(guān)系，本研究利用23個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)柱花草屬14個(gè)種的33份材料的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，23個(gè)SSR標(biāo)記在不同柱花草種間均具有多態(tài)性，共檢測(cè)到等位基因138個(gè)，每個(gè)標(biāo)記可檢測(cè)到4～10個(gè)等位基因，平均6個(gè)；每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量在0.501～0.830，平均為0.700。聚類(lèi)分析和主成分分析結(jié)果表明， 33份供試柱花草種質(zhì)可分為5類(lèi)，根據(jù)包含的基因組類(lèi)型分別命名為AB類(lèi)、AC類(lèi)、J類(lèi)、DE類(lèi)、G類(lèi)。毛葉柱花草(S.subsericea)和有鉤柱花草(S.hamata)(I)的親緣關(guān)系最近，有鉤柱花草(I)與頭狀柱花草(S.capitata)的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

柱花草；SSR；親緣關(guān)系；聚類(lèi)分析；主成分分析

柱花草屬(Stylosanthesspp.)為多年生豆科植物，原產(chǎn)于拉丁美洲，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、抗旱、飼草產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，兼具改良土壤、水土保持的功效，是全球熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)良牧草之一[1]。柱花草屬于自花授粉，且在開(kāi)花之前已經(jīng)授粉[2]。柱花草屬包含約50個(gè)種或亞種，常用的栽培品種主要來(lái)自圭亞那柱花草(Styosanthesguianensis)、有鉤柱花草(S.hamata)、糙柱花草(S.scabra)、灌木柱花草(S.seabrana)、矮柱花草(S.humilis)和頭狀柱花草(S.macrocephala)等[3]。大部分柱花草為二倍體(2n=2x=20)，也有部分為多倍體(2n=4x=40或2n=6x=60)[4]。Liu等[5]鑒定出柱花草屬的10個(gè)基本基因組類(lèi)型，并命名為A～J。柱花草傳統(tǒng)的分類(lèi)方法主要基于花果形態(tài)，早在1938年，Vogel根據(jù)莢果基部退化花軸的有無(wú)和小苞片的數(shù)量將柱花草劃分為Styposanthes(包含二倍體和多倍體)和Stylosanthes(完全為二倍體)兩大分支[6]。但是柱花草屬中有些種和亞種間的形態(tài)特征非常相近，形態(tài)學(xué)鑒定非常困難，目前還存在許多同種異名或同名異種的現(xiàn)象，近年來(lái)，不斷有新種被發(fā)現(xiàn)或重新定義[7-9]。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者利用STS、RFLP及ITS等分子標(biāo)記和葉綠體DNA序列差異對(duì)柱花草屬種間分類(lèi)進(jìn)行了研究，但由于所用手段和研究材料的不同，研究結(jié)果也存在一定差異[5,10-11]，所以深入研究柱花草屬種間的親緣關(guān)系對(duì)柱花草種質(zhì)資源研究與利用尤為重要。

SSR標(biāo)記因具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡(jiǎn)單等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，在遺傳學(xué)研究中作為一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)，已經(jīng)被廣泛于植物研究的諸多領(lǐng)域[12]。在牧草上，SSR標(biāo)記已經(jīng)在柱花草[13]、苜蓿(Medicagosativa)[14]、黑麥草(Loliumperenne)[15]、羊草(Leymuschinensis)[16]、鴨茅(Dactylisglomerata)[17]、三葉草(Trifoliumpratense)[18]、百喜草(Paspalumnotatum)[16]等草種上進(jìn)行了遺傳圖譜構(gòu)建、倍性鑒定、遺傳多樣性分析、父系分析、QTL鑒定等方面的研究[16]。近年，柱花草SSR引物的不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，為柱花草種質(zhì)資源及遺傳改良提供準(zhǔn)確了可靠的標(biāo)記[4]。本研究利用已報(bào)道的部分SSR標(biāo)記，對(duì)柱花草種間的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以進(jìn)一步為其種間的分類(lèi)提供更多的分子水平上的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用33份柱花草種質(zhì)來(lái)自柱花草屬的14個(gè)種，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草中心收集。其中7份來(lái)自澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織(CSIRO)，12份來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CATAS)熱帶作物品種資源研究所，14份引進(jìn)于哥倫比亞國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)(表1)。由于有鉤柱花草包括四倍體和二倍體兩種類(lèi)型，所以將其分為兩個(gè)種群，分別命名為有鉤柱花草(I)和有鉤柱花草(II)。所有供試材料均種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心基地，按照日常大田管理辦法進(jìn)行管理。

1.2 DNA的提取及濃度檢測(cè)

在柱花草營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，采集柱花草新鮮幼嫩葉片置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。按照中?guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心實(shí)驗(yàn)室改良CTAB法提取柱花草總DNA[19]。利用NanoVue超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare)檢測(cè)完全溶解的DNA樣品的濃度與A260/280、A260/230，然后將DNA樣品濃度按照50 ng·μL-1配置好，同時(shí)利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品。

1.3 SSR引物、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

選用中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)篩選過(guò)在8個(gè)不同柱花草種中都能有效擴(kuò)增，且條帶清晰、存在多態(tài)性的已報(bào)道的SSR標(biāo)記進(jìn)行柱花草種間親緣關(guān)系分析(表2)[19]，引物由上海生工生物工程公司合成。試驗(yàn)中Taq DNA聚合酶、dNTPs、10 × PCR Buffer(含Mg2+)及DL2000均購(gòu)自TaKaRa公司。

利用德國(guó)Biometra公司的TGRADient型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用20 μL反應(yīng)體系，包括2.0 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，1.0 μL模板DNA(50 ng·μL-1)，0.4 μL正向引物(10 μmol·L-1)，0.4 μL反向引物(10 μmol·L-1)，1.2 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)，0.3 μL Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)，剩余體積用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)電泳后，采用硝酸銀法染色，最后照相記錄[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小以DL2000 DNA marker作為分子量參考來(lái)讀取，對(duì)大小合適、清晰且易于辨認(rèn)的譜帶采用“0，1”系統(tǒng)記錄其位置，有條帶記為“1”， 沒(méi)有記為“0”。所記錄的原始數(shù)據(jù)匯總到Excel表格中并形成二進(jìn)制矩陣，用于擴(kuò)增條帶的多態(tài)性比較和聚類(lèi)分析。利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析柱花草種質(zhì)及種間的遺傳距離和相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS)，然后利用GS值采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)供試材料進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析[20]，并通過(guò)FreeTree軟件[21]采用1 000次重抽樣對(duì)聚類(lèi)圖進(jìn)行bootstrap分析。利用POPGENE 1.32軟件計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)(Number of Alleles,Na)、每個(gè)等位基因的頻率、觀察雜合度(Observed Heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Excepted Heterozygosity,He)和Shannon多態(tài)性指數(shù)(I)[22]。根據(jù)Botstein等[23]方法，利用SSR標(biāo)記每個(gè)等位基因頻率計(jì)算其多態(tài)性信息含量(Polymorphic Information Content,PIC),計(jì)算公式如下：

表1 供試的33份柱花草種質(zhì)Table 1 33 Stylosanthes accessions used in this study

注：CSIRO, 澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織;CATAS,中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院;CIAT,哥倫比亞國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)中心。

Note: CSIRO, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation; CATAS, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; CIAT, International Center for Tropical Agriculture.

式中，n表示每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)目，Pi、Pj表示第i、j個(gè)等位基因在供試材料中出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草種間SSR擴(kuò)增特點(diǎn)

選用的23對(duì)SSR引物在33份柱花草材料中均具有多態(tài)性，共檢測(cè)到138個(gè)等位基因，每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)到的等位基因數(shù)為4～10個(gè)，平均6個(gè)(表2)。23個(gè)SSR標(biāo)記的觀察雜合度(Ho)的變化范圍為0.000～0.667，平均值為0.225，而期望雜合度(He)的變化范圍為0.572～0.861，平均值為0.750(表2)。標(biāo)記SSR23的觀察雜合度最高，標(biāo)記SSR5的預(yù)期雜合度最大。各SSR標(biāo)記的多態(tài)信息含量(PIC)值變化范圍為0.501～0.830，平均為0.700。各SSR標(biāo)記的Shannon多樣性指數(shù)(I)變異范圍為1.012～2.039，其平均值為1.516。多態(tài)信息含量(PIC)值和Shannon多樣性指數(shù)(I)都以標(biāo)記SSR5最大，標(biāo)記SSR101最小，表明SSR5具有較高的多態(tài)性檢測(cè)效率。

表2 23對(duì)SSR引物信息及特征分析Table 2 Information and characterization of 23 SSR markers

2.2 柱花草種質(zhì)間的遺傳多樣性與聚類(lèi)分析

利用NTSYS-pc 2.10e分析軟件，對(duì)供試柱花草種質(zhì)資源的進(jìn)行遺傳多樣性，結(jié)果表明，33份種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)GS變化范圍為0.557～0.993，平均為0.715。其中，CIAT 167有鉤柱花草與品148頭狀柱花草的遺傳相似性最小。基于23對(duì)SSR引物的UPGMA聚類(lèi)分析表明，在相似系數(shù)0.760處，33份柱花草種質(zhì)資源可以明顯地被分為5類(lèi)(圖1)：3份糙柱花草、2份灌木粘質(zhì)柱花草、3份灌木柱花草和3份粘質(zhì)柱花草被歸為一類(lèi)，由于他們的基因組類(lèi)型為A、B或AB類(lèi)，所以命名為AB類(lèi)；6份有鉤柱花草、1份毛葉柱花草和3份矮柱花草被歸為一類(lèi)，由于他們的基因組類(lèi)型為AC或C類(lèi)，所以命名為AC類(lèi)；含有J類(lèi)基因組的CIAT1291狹葉柱花草單獨(dú)分為一類(lèi)；3份頭狀柱花草(DD)和2份大頭柱花草(DDEE)被歸為DE類(lèi)；剩下的3份圭亞那柱花草(GG)、Fine stem馬弓形柱花草(GG)、CIAT10121大葉柱花草(GG)和CIAT1361細(xì)莖柱花草(GG)被歸為G類(lèi)。

2.3 主成分分析

基于SSR數(shù)據(jù)矩陣，對(duì)33份供試柱花草材料進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分解釋的變異分別為72.51%、6.32%和4.25%，合計(jì)占總變異的83.08%。根據(jù)前3個(gè)主成分制作33份供試材料的三維散點(diǎn)分布圖(圖2)，位置相靠近者表示關(guān)系密切，遠(yuǎn)離者表示關(guān)系疏遠(yuǎn)。比較圖2和圖1發(fā)現(xiàn)，主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致，同樣將33份柱花草種質(zhì)分為5類(lèi)，其中AC類(lèi)和G類(lèi)比較集中，而AB類(lèi)和DE類(lèi)相對(duì)分散。相對(duì)而言，主成分分析(圖2)比聚類(lèi)分析(圖1)能更直觀地揭示不同材料間的親緣關(guān)系。

圖1 柱花草種間SSR分析聚類(lèi)圖Fig.1 Dendrogram of Stylosanthes species based on SSR information

圖2 33份材料第1、2、3主成分三維散點(diǎn)圖Fig.2 3D-scatterplot based on the first, second and third principal components of 33 materials

注：圖中數(shù)字表示材料編號(hào)同表1。

Note: The numbers for materials in the figure are corresponding to the numbers of accession name given in Table 1．

2.4 柱花草不同物種間的親緣關(guān)系分析

如果將33份供試柱花草資源按種可分為14個(gè)不同的組，但考慮到不同倍性對(duì)親緣關(guān)系的影響，將有鉤柱花草分為四倍體有鉤柱花草和二倍體有鉤柱花草，分別命名為有鉤柱花草(Ⅰ)和有鉤柱花草(Ⅱ)。利用SSR數(shù)據(jù)矩陣對(duì)這15個(gè)種群進(jìn)行相似系數(shù)和遺傳距離分析發(fā)現(xiàn)(表3)，有鉤柱花草(Ⅰ)和毛葉柱花草的相似系數(shù)最大，為0.902，大于有鉤柱花草(Ⅰ)和有鉤柱花草(Ⅱ)的相似系數(shù)(0.872)。頭狀柱花草除了與大頭柱花草的相似系數(shù)較高(0.824)外，與其他種群的相似系數(shù)均較低。有

鉤柱花草(Ⅰ)和頭狀柱花草的相似系數(shù)最小，為0.575。遺傳距離分析結(jié)果與相似系數(shù)分析結(jié)果相反，有鉤柱花草(Ⅰ)和毛葉柱花草之間的遺傳距離最小，為0.098，而有鉤柱花草(Ⅰ)和頭狀柱花草之間的遺傳距離最大，為0.425。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記是作物遺傳學(xué)研究和分子標(biāo)記輔助育種的重要工具，SSR標(biāo)記相對(duì)于其他基于PCR的分子標(biāo)記，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡(jiǎn)單等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，這使SSR技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域得以應(yīng)用。目前，SSR技術(shù)主要應(yīng)用于柱花草種內(nèi)遺傳多樣性分析及和核心種質(zhì)的建立。蔣昌順等[29]利用18個(gè)SSR標(biāo)記成功地將42份圭亞那柱花草(S.guianensis)種質(zhì)分為6類(lèi)，并證明其效果好于RAPD標(biāo)記。Santos-Garcia等[30]利用20個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)150份圭亞那柱花草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Chandra等[4]開(kāi)發(fā)了133個(gè)柱花草SSR標(biāo)記，并用其中41個(gè)對(duì)20份灌木柱花草進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Santos-Garcia等[31]用13個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)134份大頭柱花草種質(zhì)進(jìn)行了基因型分析最終建立了含23份種質(zhì)的大頭柱花草核心種質(zhì)，同時(shí)用15個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)192份頭狀柱花草種質(zhì)進(jìn)行了基因型分析并最終建立了含13份種質(zhì)的頭狀柱花草核心種質(zhì)。本研究通過(guò)分析來(lái)自柱花草屬14個(gè)種的33份供試柱花草材料的遺傳多樣性，首次利用SSR標(biāo)記分析了柱花草種間的親緣關(guān)系。23個(gè)SSR標(biāo)記在33份供試材料中均有多態(tài)性，共檢測(cè)到的等位基因138個(gè)，每個(gè)標(biāo)記可檢測(cè)到4～10個(gè)等位基因，平均6個(gè)。利用SSR標(biāo)記能將每份供試柱花草很好地分開(kāi)，同種柱花草種質(zhì)資源聚在一起，相互間相似系數(shù)較高，而不同柱花草種間相互分開(kāi)，遺傳距離較遠(yuǎn)(圖1，表3)，且該分類(lèi)結(jié)果與植物學(xué)分類(lèi)結(jié)果較一致。因此，SSR標(biāo)記不僅能用于柱花草種質(zhì)遺傳多樣性的分析，還是柱花草種間親緣分析的有效方法。

柱花草傳統(tǒng)的分類(lèi)方法主要是基于花果形態(tài)的差異，但由于柱花草分布廣泛、種類(lèi)繁多、花果形態(tài)復(fù)雜多變，使得柱花草屬內(nèi)種和亞種的形態(tài)學(xué)上鑒

定非常難，種的概念及其特性目前還存在多種觀點(diǎn)，分子標(biāo)記方法對(duì)闡述物種間遺傳關(guān)系提供了有力的手段[32]。國(guó)外有學(xué)者利用STS、RFLP及ITS等分子標(biāo)記和葉綠體DNA序列差異對(duì)柱花草屬種間親緣關(guān)系進(jìn)行了研究[5,10-11]。本研究利用23個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)柱花草屬14個(gè)種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明有鉤柱花草(Ⅰ)和毛葉柱花草的相似系數(shù)最大，為0.902，大于有鉤柱花草(Ⅰ)和有鉤柱花草(Ⅱ)的相似系數(shù)(0.872)，和形態(tài)學(xué)上的分類(lèi)不一致，這可能是因?yàn)橛秀^柱花草(Ⅰ)和毛葉柱花草擁有相同的倍性及基因組類(lèi)型。有鉤柱花草(Ⅰ)和頭狀柱花草的相似系數(shù)最小，為0.575，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。來(lái)自圭亞那柱花草復(fù)合體的圭亞那柱花草、大葉柱花草、馬弓形柱花草和細(xì)莖柱花草親緣關(guān)系較近，相互間相似系數(shù)較大，為0.785～0.846，同時(shí)被歸為G類(lèi)(圖1、2)，這一結(jié)果與用其他分子標(biāo)記分析的結(jié)果一致[5,10-11]。頭狀柱花草和大頭柱花草都含有D類(lèi)基因組，兩者相似系數(shù)較高，為0.824，但兩者與其他種群的相似系數(shù)均較低，這與Gilles和Abbott[11]利用葉綠體DNA序列差異分析結(jié)果吻合。本研究的SSR分析結(jié)果還為判斷四倍體柱花草的祖先提供了證據(jù)：糙柱花草(AABB)、灌木柱花草(AA)和粘質(zhì)柱花草(BB)被歸為AB類(lèi)，進(jìn)一步支持了灌木柱花草和粘質(zhì)柱花草是糙柱花草祖先的觀點(diǎn)[33]。同樣，有鉤柱花草(Ⅰ)(AACC)、有鉤柱花草(Ⅱ)(AA)和矮柱花草(CC)被歸為AC類(lèi)支持了二倍體有鉤柱花草和矮柱花草是四倍體有鉤柱花草祖先的說(shuō)法[34]。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Genetic relationships amongStylosanthesspecies revealed by SSR analysis

DING Xi-peng, LUO Xiao-yan, ZHANG Long, WANG Wen-qiang, BAI Chang-jun

(Institute of Tropical Crops Genetic Resources, CATAS, Danzhou 571737, China)

To investigate genetic relationships amongStylosanthesspecies, a total of 33 accessions from 14Stylosanthesspecies were studied using 23 simple sequence rpeats (SSR) markers. All 23 SSR markers were polymorphic among 33Stylosanthesaccessions. A total of 138 alleles were generated by 23 SSR markers among differentStylosanthesaccessions. The number of alleles per SSR marker ranged from 4 to 10 with an average of 6 alleles. The polymorphic information content per SSR marker varied from 0.501 to 0.830, with an average of 0.700. Based on the results of analysis of cluster and principal components, the 33Stylosanthesaccessions were divided into 5 separate clusters, which were named to be cluster AB, cluster AC, cluster J, cluster DE and cluster G based on genome contained. The highest and lowest genetic relations were presented betweenS.subsericeaandS.hamata(I),S.hamata(I) andS.capitata, respectively.

Stylosanthes; SSR markers; genetic relationship; cluster analysis; principal components analysis

BAI Chang-jun E-mail: baichangjun@126.com

10.11829j.issn.1001-0629.2015-0155

2015-03-19 接受日期：2015-06-01

海南省自然科學(xué)基金(313067)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所)資助項(xiàng)目(1630032013002)；現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)體系牧草崗位科學(xué)家經(jīng)費(fèi)(CRAS-35)；中南美洲種質(zhì)資源收集與合作研究(2011DFB31690)；農(nóng)業(yè)部“948”重點(diǎn)項(xiàng)目“重要熱帶作物特異種質(zhì)資源的引進(jìn)”[2011-G13(5)]

丁西朋(1982-)，男，河南封丘人，助理研究員，博士，主要從事熱帶牧草遺傳育種研究。E-mail:xipding@163.com

白昌軍(1967-)，男，甘肅民勤人，研究員，博士，主要從事熱帶牧草種質(zhì)資源和栽培利用研究。E-mail:baichangjun@126.com

S32

A

1001-0629(2015)10-1594-09*

丁西朋,羅小燕,張龍,王文強(qiáng),白昌軍.柱花草種間親緣關(guān)系SSR分析[J].草業(yè)科學(xué),2015,32(10):1594-1602.

DING Xi-peng,LUO Xiao-yan,ZHANG Long,WANG Wen-qiang,BAI Chang-jun.Genetic relationships amongStylosanthesspecies revealed by SSR analysis[J].Pratacultural Science，2015,32(10)：1594-1602.