宮靜，吳根英，高修霞

(廣東省第二中醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州 510095)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)共同參與的慢性氣道炎癥性疾病，目前公認(rèn)Th2細(xì)胞在哮喘氣道和肺組織的募集、浸潤是引起病理改變的關(guān)鍵。氣道炎癥反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑。氣道重塑導(dǎo)致了氣道不可逆阻塞和持續(xù)的氣道高反應(yīng)性，從而令哮喘疾病變得更為難治[1]。多種信號通路參與哮喘發(fā)病，例如ERK1/2通路[2]，NF-kB信號通路[3]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是類白細(xì)胞介素7的細(xì)胞因子，來源于上皮細(xì)胞，在哮喘患者的氣道平滑肌束中表達(dá)增加，它可以使肥大細(xì)胞活化，生成大量的趨化因子和細(xì)胞因子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘TSLP表達(dá)水平和病情的嚴(yán)重度成正相關(guān)[5]。OX40/OX40L(OX40配體)協(xié)同刺激通路能夠促進(jìn)CD+T細(xì)胞活化、增殖、遷移以及記憶性T細(xì)胞的形成，并在Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的極化中起關(guān)鍵作用，與哮喘關(guān)系密切[6]。OX40的表達(dá)是TSLP誘導(dǎo)成熟的樹突狀細(xì)胞，促使Th0細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞能力的非常重要因素[7]。TSLP-OX40信號通路在慢性哮喘小鼠氣道重塑的研究不多，本研究通過建立小鼠慢性哮喘模型，研究TSLP、OX40在支氣管哮喘小鼠肺組織中的表達(dá)及地塞米松對其表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步探討TSLP-OX40信號通路在氣道重塑中的作用。

1　材料與方法

1.1材料 SPF級BALB/C雌性小鼠，體重為17-20g，購買于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)(Sigma 公司)；地塞米松注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)品批號：51703251)；TSLP抗體(Abclonal公司)；OX40多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1哮喘模型的建立 30只SPF級BALB/C雌性小鼠隨機(jī)分3組，分別為對照組、哮喘組和地塞米松組(地米組)，每組各10只。參考文獻(xiàn)[8]建立慢性哮喘小鼠動物模型，每只哮喘組和地米組小鼠于第 1d，第 14d腹腔注射 0.2ml致敏液 (含OVA10μg，氫氧化鋁凝膠 100μg)，從第 21d 開始，霧化吸入OVA溶液（2.5%）30min，每周3次，造模時間共8周。地米組在每次霧化OVA前0.5h腹腔注射地塞米松，地塞米松使用劑量按10mg/kg計算。對照組以0.9%氯化鈉注射液代替OVA。造模及用藥過程觀察動物的一般狀況，如精神狀態(tài)、有無氣喘、進(jìn)食量和大小便等情況。

1.2.2標(biāo)本采集處理 造模結(jié)束后，對小鼠氣管插管，在右主支氣管處結(jié)扎右肺，用0.3ml冰磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行左肺支氣管肺泡灌洗3次，以回收液體量>80%計為合格，4℃，1000r/min離心15min后，用血細(xì)胞計數(shù)板對沉渣進(jìn)行細(xì)胞分類及計數(shù)。離斷頸椎處死小鼠后，留取左肺組織用多聚甲醛固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色。右肺組織保存于-70℃冰箱備用提取總蛋白。

1.2.3肺組織切片HE染色 多聚甲醛固定后的組織脫水透明、浸蠟包埋；包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成薄片，厚度為5μm，每份標(biāo)本切3片；脫蠟水化；Gill改良蘇木精液5min左右；自來水洗1min，75%鹽酸乙醇分化30s，自來水洗1min；加酸化伊紅乙醇液1-2min；脫水、透明和封固。

1.2.4氣道壁厚度及平滑肌厚度測定 使用Leica顯微鏡觀察HE染色的肺組織切片，挑選有完整橫斷面不含軟骨的支氣管進(jìn)行測量，采用圖像分析軟件IPP6.0分別測量支氣管平滑肌面積(airway smooth muscle area，Wam)、 支 氣 管 管 壁 總 面 積(bronchial wall area，Wat)以及支氣管基底膜周徑(length of basement membrane，Pbm，)。 并用 Pbm 對Wam、Wat進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以Wam/Pbm代表平滑肌厚度、Wat/Pbm代表氣道壁厚度。

1.2.5Western blot檢測肺組織中TSLP蛋白、OX40蛋白 稱取肺組織，測蛋白總濃度，10%SDSPAGE，各樣品上樣量50ug，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，4℃封閉過夜，分別加一抗 TSLP、β-actin，平搖、洗膜，加二抗，化學(xué)發(fā)光。計算TSLP與內(nèi)參的比值作為TSLP蛋白的相對表達(dá)水平。OX40蛋白測定步驟基本同TSLP蛋白。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組間比較采用單因素方差分析，兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過程的等級Pearson相關(guān)法。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1動物一般情況 哮喘組小鼠和地米組小鼠激發(fā)后均有伏地不動、呼吸加深加快表現(xiàn)，哮喘組還存在腹部鼓動明顯、口唇紫紺、排泄物增多的癥狀，對照組無上述表現(xiàn)。

2.2小鼠BALF炎癥細(xì)胞分類和計數(shù) 哮喘組小鼠細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)均較對照組增多(P<0.05)；地米組細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)和嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)較哮喘組有所下降，但仍比對照組增高(P<0.05，表 1)。

表1　3組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)(×104ml-1，x±s)

2.3HE染色結(jié)果 鏡下可見對照組小鼠肺組織形態(tài)正常，支氣管上皮完整、無明顯炎癥浸潤。哮喘組小鼠支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺間質(zhì)也可見嗜酸性粒細(xì)胞存在，黏膜皺褶增多，黏膜下層增寬，氣管管腔縮小，平滑肌增厚明顯(圖1A、B)；地米組上述表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕(圖1C)。見圖1。

圖1　小鼠肺組織病理學(xué)變化（HE，×400)

2.4支氣管壁厚度(Wat/Pbm)、平滑肌層厚度(Wam/Pbm)比較 哮喘組Wat/Pbm、Wam/Pbm較對照組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；地米組Wat/Pbm、Wam/Pbm低于哮喘組，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表 2)。

表2　各組小鼠Wat/Pbm、Wam/Pbm比較(x±s，n=10)

2.5肺組織TSLP蛋白、OX40蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，對于TSLP蛋白，哮喘組(1.19±0.12)高于對照組(0.26±0.10)(P<0.05)；地米組(0.90±0.15)低于哮喘組高于對照組，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。對于 OX40 蛋白，哮喘組(0.88±0.10)高于對照組(0.23±0.05)，地米組(0.49±0.07)低于哮喘組高于對照組，上述差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2　3組小鼠TSLP蛋白、OX40蛋白的表達(dá)

2.6相關(guān)性分析 小鼠肺組織TSLP蛋白表達(dá)量與支氣管的管壁厚度、平滑肌厚度呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為 0.867、0.847，P=0.000)；肺組織的 OX40蛋白水平與TSLP蛋白表達(dá)呈正相關(guān) (相關(guān)系數(shù)分別為 0.869，P=0.000)。

3　討論

哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥，多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu)成了一個與炎癥細(xì)胞相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，使粘液分泌增加，血管滲出增多，氣道收縮痙攣，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高。普遍認(rèn)為輔助性T淋巴細(xì)胞的兩種亞型Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，主要表現(xiàn)為Th1亞群功能降低和數(shù)目減少，Th2亞群功能亢進(jìn)和數(shù)目增多。Th2細(xì)胞在哮喘肺組織和氣道的募集、浸潤即Th2反應(yīng)亢進(jìn)是引起哮喘病理改變的關(guān)鍵。慢性炎癥反復(fù)刺激和上皮結(jié)構(gòu)的破壞組織增生可以引起哮喘的氣道重塑，使得哮喘疾病的治療更加棘手。在不同嚴(yán)重程度哮喘的大氣道和小氣道都可能存在氣道重塑[9]。

近年來的研究表明，TSLP可促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答，是啟動人類多種過敏性疾病，如哮喘、過敏性皮炎等的重要因子。TSLP誘導(dǎo)氣道炎癥，參與氣道重塑，拮抗TSLP可明顯減輕氣道炎癥，有人把他形象的比喻成氣道炎癥和氣道重塑的總開關(guān)[10]。OX40L的表達(dá)是TSLP誘導(dǎo)成熟的DC，使初始T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞能力的非常重要的因素[8]。對比使用TSLP、PolyIC和CD40L激活的DC，發(fā)現(xiàn)只有TSLP-DC可以在分子和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)OX40L11]，OX40L屬于TNF超家族，而OX40則屬于TNF受體超家族成員，主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞表面，OX40/OX40L在Th細(xì)胞增殖分化中有著重要作用。通過阻斷OX40可以抑制Th2相關(guān)型抗體IgG和IgE的產(chǎn)生[11]。我們參考文獻(xiàn)通過OVA致敏和激發(fā)，成功制作了小鼠慢性哮喘模型，并設(shè)立生理鹽水誘導(dǎo)的正常小鼠做對照。研究表明，癥狀表現(xiàn)方面，哮喘小鼠的陽性特征最為明顯，出現(xiàn)了腹部鼓動明顯、口唇紫紺、排泄物增多的癥狀。從病理學(xué)方面，觀察到存在明顯的氣道炎癥和氣道重塑特征，其主要的變化包括氣道壁炎性細(xì)胞浸潤、黏液分泌增多，氣道壁厚度和氣道平滑肌厚度的增加。給予地塞米松處理后，無論從癥狀表現(xiàn)方面，還是在病理改變方面都有明顯改善。實驗表明，哮喘組小鼠TSLP蛋白表達(dá)較對照組相比是上調(diào)的，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，OX40蛋白表達(dá)較對照組也明顯增加 (P<0.05)，地塞米松藥物可抑制TSLP和OX40蛋白的表達(dá) (P<0.05)。通過相關(guān)性分析，TSLP與OX40兩者呈正相關(guān)。哮喘組小鼠TSLP可能通過OX40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)了Th2細(xì)胞的分化。

目前公認(rèn)糖皮質(zhì)激素是控制及預(yù)防哮喘發(fā)作最有效的藥物，可抑制遲發(fā)反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性，抗炎作用明顯，臨床應(yīng)用廣泛，已成為治療哮喘的一線藥物。我們的研究發(fā)現(xiàn)地米可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑，TSLP與OX40蛋白的表達(dá)較哮喘組也是下降的，由此推斷TSLP-OX40信號通路可能是糖皮質(zhì)激素作用的靶點。作為本課題的延伸，下一步計劃敲除TSLP基因，觀察OX40/OX40L表達(dá)及Th2細(xì)胞因子的變化來進(jìn)一步探討哮喘的發(fā)病機(jī)制。