李奇薇 李超婧 王富軍,2* 丁 雯 胡思寒 王 璐,2

1(東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海 201620)2(紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，上海 201620)

引言

對于組織工程這種旨在幫助已被疾病、損傷、或先天性缺陷所破壞的組織再生[1]的技術(shù)，其內(nèi)在的核心之一是設(shè)計和制造一種用于體外細胞接種或體內(nèi)培養(yǎng)的支架，因此組織工程支架必須具有良好的生物相容性。生物相容性是指生物材料植入人體后能夠保持適當細胞活性的能力，即適合細胞的黏附、增殖、分化和功能表達，同時也不會在體內(nèi)引起明顯的炎癥反應(yīng)、免疫原性和生物毒性[2]。為盡可能提高支架的生物相容性，了解材料對細胞的影響機制至關(guān)重要。

在體內(nèi)，細胞生活在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)中。天然的細胞外基質(zhì)由多種蛋白原纖維和交織在糖胺聚糖鏈水合網(wǎng)絡(luò)中的纖維組成，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對組織細胞起到物理機械性支持作用；除此之外，還提供直接與細胞結(jié)合的生物活性肽序列，并通過細胞內(nèi)信號級聯(lián)向細胞膜受體傳遞信號[3]，最終引導(dǎo)細胞活動，包括增殖、分化、凋亡等。因此，對細胞/細胞外基質(zhì)進一步了解，可能會使支架在植入時獲得更佳的生物學(xué)活性。

支架的表面性能(如潤濕性[4-5]、表面電荷、化學(xué)官能團[6]等)是影響細胞行為的重要因素之一。當植入物與生物環(huán)境接觸時，立即發(fā)生蛋白質(zhì)吸附(如血漿纖連蛋白)，而表面效應(yīng)通常通過與細胞附著蛋白中RGD基序結(jié)合的整合素來介導(dǎo)細胞的黏附和增殖。通過表面改性等方法改變生物材料的表面能或潤濕性，也就改變了細胞與表面相互作用，從而可以調(diào)控細胞的活動[7]。利用表面改性、接枝天然成分或者生物因子的方法，通?？梢蕴岣呔廴樗?polylactide，PLA)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)等常用支架材料的生物相容性，除此之外還選用與殼聚糖、膠原等天然聚合物共混的方法。利用和體內(nèi)ECM成分相似的天然分子所具有的親水基團和其他官能團，可促進細胞黏附和增殖。支架常用的改性方法及其潛在應(yīng)用如表1所示。

表1 支架常用的改性方法及其潛在應(yīng)用Tab.1 The common modification of scaffolds and its potential applications

影響細胞行為的另一個關(guān)鍵是支架的物理結(jié)構(gòu)特征。最近發(fā)展起來的表面圖案技術(shù)為細胞-材料相互作用的基礎(chǔ)科學(xué)研究提供了一種的獨特方法：采用表面刻蝕、接觸印刷等圖案化技術(shù)，制備出微米尺度以及納米尺度的凹槽[18]、脊[19]、柱[20]等有序結(jié)構(gòu)和無規(guī)則表面(通常用粗糙度來表征)，或者進一步對結(jié)構(gòu)表面進行改性，針對性地對單個影響因素的作用機制進行研究[21]。例如，Wan等發(fā)現(xiàn)，與平滑表面對照相比，微米尺度(2.2 μm)和納米尺度(450 nm)凹坑的兩個表面上的成骨細胞黏附增加，并且具有納米凹坑的表面優(yōu)于微孔表面[22]。同樣地，當研究成骨細胞樣MG-63細胞在鈦表面黏附情況時，成骨細胞相比光滑表面較多比例地附著在粗糙表面；但是在研究牙齦和牙周韌帶成纖維細胞和上皮細胞時，表明這兩種細胞更易黏附到平滑鈦表面上。兩個結(jié)果也證實，不同細胞對不同尺度、拓撲結(jié)構(gòu)的響應(yīng)程度不同[23]。

纖維型支架可以從生化性能和物理結(jié)構(gòu)兩方面更好地模擬體內(nèi)ECM，在組織工程應(yīng)用中具有巨大的前景。在本綜述中，主要論述常用制備纖維型支架的方法，即靜電紡絲技術(shù)；爾后，還進一步分析通過該方法制備的支架的纖維結(jié)構(gòu)對細胞行為的影響。

1 纖維結(jié)構(gòu)對細胞行為的影響

目前有3種主要的制備纖維型支架的方法：靜電紡絲、相分離[24]和自組裝[25]。靜電紡是一種在幾何學(xué)、形態(tài)形貌學(xué)和生物化學(xué)方面制造模擬天然細胞外基質(zhì)的工程化支架的常用技術(shù)[26]。靜電紡技術(shù)在直徑、密度、取向等方面易于調(diào)整，以獲得優(yōu)異的機械物理性能。制備的纖維支架因其較小的纖維直徑所提供的高比表面積、高縱橫比和高微孔性，所以具有增強細胞黏附、生長和分化的潛能。同時，高比表面積和孔隙率具有如下優(yōu)點：提供可調(diào)節(jié)的流體吸收，藥物和生物分子遞送，保證足夠的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)擴散，有效地去除代謝廢物[27]。最新的研究表明，支架的纖維結(jié)構(gòu)同樣是調(diào)節(jié)細胞旁分泌功能的關(guān)鍵。例如，間充質(zhì)干細胞(MSC)相比平板而言，在靜電紡纖維支架上生長會產(chǎn)生更高水平的抗炎因子和促血管生成因子，增強MSC-支架構(gòu)建體的治療效果[28]。因此，靜電紡纖維支架的設(shè)計成為組織再生領(lǐng)域(如脊髓損傷再生、神經(jīng)修復(fù)、皮膚血管再生等方面)的研究熱點之一。

纖維型支架的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)參數(shù)包括纖維直徑，孔徑和取向，會在不同尺度上影響及調(diào)節(jié)細胞活動(包括細胞的形態(tài)、遷移、增殖、分化和最終的組織重塑)。

1.1 纖維直徑

黏附在纖維上的細胞受到纖維尺寸的影響，尤其是亞微米級到納米級的纖維對增強細胞的黏附及增殖影響重大[2]。Tian等在聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)/膠原復(fù)合納米纖維支架上接種NIH3T3成纖維細胞，纖維直徑范圍為500 nm～10 μm，發(fā)現(xiàn)與3～5 μm和10 μm等微米級的纖維相比，500 nm纖維上附著的細胞數(shù)量明顯增多。這表明,微米尺度和納米尺度結(jié)構(gòu)的細胞-材料相互作用，其差異是顯著的[29]。據(jù)文獻報道，人的細胞在直徑比自身尺寸小的纖維上可以更好地附著，成纖維細胞黏附和遷移所需的最小纖維直徑以及成纖維細胞能橋接的最大纖維間距分別為10和200 nm[27]。因此，百納米級范圍內(nèi)的纖維更類似于ECM纖維的尺寸(直徑在10～300 nm之間)，從而有利于細胞的黏附和增殖。

纖維直徑對細胞附著的影響還帶來細胞形態(tài)的變化。當細胞在直徑大于其自身的纖維上附著時可以在纖維表面完全擴散，相當于在二維平面上生長，通常表現(xiàn)為橢圓狀；相反，當纖維黏附在小直徑纖維上時，具有擴散性移動受體的細胞膜圍繞具有相容配體的纖維纏繞，受體與配體的結(jié)合使細胞膜曲率增加，構(gòu)象傾向于細長的紡錘形態(tài)(見圖1(a)、(b))[29]。細胞處在纖維支架中又會受到纖維空間排列以及纖維間距的影響，使得對細胞形態(tài)的影響變得復(fù)雜。例如，Catherine等利用靜電紡技術(shù)制備不同直徑的PCL纖維支架，并在纖維表面涂覆層粘連蛋白后接種神經(jīng)細胞，結(jié)果表明：細胞纖維在小直徑纖維(平均直徑為800 nm)上沿纖維分布并呈現(xiàn)多級形態(tài)，而在大直徑纖維上(平均直徑為10 μm)顯示出細長的雙極形態(tài)(紡錘形態(tài))[30]。

1.2 孔結(jié)構(gòu)

孔結(jié)構(gòu)是影響細胞活動的另一重要因素，其大小會直接影響細胞的遷移，進而影響組織的重塑過程。通過靜電紡技術(shù)制備纖維支架，其纖維直徑會影響支架的孔徑[31]。多個理論模型證明，支架的平均孔徑隨著纖維直徑的增加而增加，因此研究孔結(jié)構(gòu)對細胞影響時需要對靜電紡纖維直徑嚴格控制[32]。而相分離技術(shù)在控制支架的孔結(jié)構(gòu)方面具有特殊的優(yōu)勢，利用冷凍干燥法與鹽分離法或者與致孔劑結(jié)合，可以較為精確地控制孔徑大小[33-34]。

Hu等使用冷凍干燥法制備了不同孔徑(35～75 μm、75～100 μm)的PCL膜，在接種人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)后發(fā)現(xiàn)，相比平膜和小孔徑膜，HUVECs在較大孔徑的PCL膜上增殖能力得到增強[35]。除內(nèi)皮細胞外，多種研究表明：5～15 μm的孔徑適于成纖維細胞在支架上生長，40～100 μm適于骨細胞增長[36]。但是，支架的最佳孔徑仍有爭議，例如其他文獻證明15～40 μm的孔徑適合新骨的形成[37]，需要更多的數(shù)據(jù)支持。

通過上述舉證可以發(fā)現(xiàn)，支架的孔徑一般都為微米級，這是由于細胞的增殖需要足夠的空間支持，若支架的孔徑小于細胞直徑，會限制細胞在支架內(nèi)的遷移，并且可能形成二維組織，從而成為重建三維組織的障礙。因此，擴大支架的孔隙率與孔徑成為靜電紡技術(shù)的改進方向之一。

1.3 纖維取向

天然ECM纖維在空間上表現(xiàn)出不同程度的取向，例如肌腱中膠原纖維的取向在生長后期變得高度一致，并且除了肌腱組織外，包括韌帶、肌肉、心臟、血管在內(nèi)的多種組織都有取向的纖維構(gòu)成，所以正確了解纖維取向?qū)毎挠绊?，對支架的發(fā)展是至關(guān)重要的。有研究證明，取向的纖維會對細胞組織和功能產(chǎn)生影響[38-39]。

Chiara等用離子交聯(lián)劑制備出殼聚糖靜電紡支架，在纖維隨機和取向兩種支架上培養(yǎng)C2C12成肌細胞系,結(jié)果表明:隨機纖維支架上黏附的細胞要小于取向纖維支架上黏附的細胞；同時，取向纖維上的細胞具有良好的生物活力，且在培養(yǎng)時間內(nèi)呈指數(shù)增長；隨機纖維上的細胞在一半培養(yǎng)天數(shù)時的細胞數(shù)量比最終的細胞數(shù)量略有增加，但無明顯差異[40]。另外，在PCL/膠原纖維上培養(yǎng)人類脂肪基質(zhì)細胞(hASCs)，結(jié)果表明hASCs在取向的纖維上比隨機纖維顯示出更為細長的細胞形態(tài)、更高的增殖和遷移速率。同時，hASCs相關(guān)基因的表達在取向纖維上的合成能力更高[41]。這說明，細胞的黏附和增殖受到纖維取向的調(diào)控。

纖維的取向?qū)毎螒B(tài)的影響也受纖維直徑的影響。較大直徑纖維上的細胞方向與纖維的取向一致，而在較小直徑纖維上的細胞與纖維的取向有較大偏差，其形態(tài)與隨機纖維上的細胞類似，這是由于細胞通常黏附在多根纖維上，所以細胞在纖維上常呈現(xiàn)簇狀生長(見圖1(c)～(e))[1]。細胞形態(tài)的不同導(dǎo)致細胞的遷移速度不同，紡錘形態(tài)的細胞遷移最快(約50 μm/h)，多邊形態(tài)的細胞遷移最慢(約20 μm/h)[42]。

除此之外，不同空間排列的纖維支架通過改變細胞形態(tài)以及細胞骨架上的張力影響細胞的分化[43]。例如，間充質(zhì)干細胞(MSC)在隨機纖維上更多地形成軟骨組織以及隨后的組織骨化，而在取向纖維上細胞多分化成肌腱組織[44]。

圖1 細胞在不同纖維表面的形態(tài)示意。(a)細胞在單根小直徑纖維上呈紡錘體形態(tài)；(b)細胞在單根大直徑纖維上完全鋪展呈橢圓狀；(c)細胞在隨機纖維表面呈多極形態(tài)；(d)細胞在取向纖維表面呈紡錘形態(tài)；(e)細胞在密集的取向纖維表面呈多極形態(tài)Fig.1 Schematic illustration of cytoskeletal arrangements on different fiber structures.(a)Cells appear spindle-shaped on a single small diameter fiber;(b)Cells appear fully spread on a single large diameter fiber;(c) Cells exhibit multipolar morphology on the surface of the random fibers; (d) Cells are spindle-shaped on aligned fibers (e) Cells exhibit a multipolar morphology on the surface of the dense aligned fibers

2 采用靜電紡技術(shù)制備不同的纖維結(jié)構(gòu)

靜電紡在過去10年中得到了廣泛的發(fā)展，并以其低成本性、易操作性和參數(shù)可調(diào)性成為制備不同結(jié)構(gòu)支架的常用方法。雖然靜電紡絲是一個相對簡單的過程，但許多變量影響纖維的結(jié)構(gòu)，這些影響因素主要包括聚合物溶液性能(導(dǎo)電性、表面張力、黏度、分子量、流速等)、加工參數(shù)(流速、噴絲頭與接收裝置之間的距離、電壓等)以及環(huán)境因素(溫度、濕度等)，這些影響因素之間的協(xié)同相互作用對靜電紡絲纖維的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了強烈的影響。為擴展靜電紡支架在生物醫(yī)用領(lǐng)域的應(yīng)用，通常對靜電紡技術(shù)進行改進或者同其他技術(shù)復(fù)合，從而得到精確、可控的纖維結(jié)構(gòu)。

2.1 取向纖維結(jié)構(gòu)

制備取向纖維結(jié)構(gòu)最常用的方法是采用滾筒收集裝置(見圖2(a))，通過調(diào)整滾筒轉(zhuǎn)速及噴絲距離可以得到取向良好的纖維結(jié)構(gòu)[45]。雖然這種技術(shù)在生產(chǎn)高度取向的纖維方面運行良好，但是滾筒轉(zhuǎn)速除影響纖維取向度外還影響纖維的直徑，一般來講纖維直徑與旋轉(zhuǎn)速度成反比，且無法對纖維間距進行控制，所以通過滾筒制備的支架的應(yīng)用范圍受到限制[46]。

采用輔助電場來精確地控制靜電紡絲的過程，也可以制備取向的纖維或交叉排列的纖維結(jié)構(gòu)(見圖2(b))。也就是說，通過控制陽極和陰極之間宏觀電場的形狀和強度，以抑制噴射流的不穩(wěn)定性[1]。Lisa等利用輔助電極的方法對聚酰亞胺和可生物降解的聚合物PGA進行靜電紡，制備出高度取向的纖維，直徑約為10 μm，纖維間距在25～30 μm之間；而PGA取向纖維的直徑約為500 nm，纖維間距為7～10 μm[47]。根據(jù)這個原理，還可以利用導(dǎo)電電極的間隙排列來制備取向纖維[48]。

圖2 制備取向纖維的靜電紡示意。(a)利用滾筒接收裝置制備取向纖維；(b)利用輔助電極制備取向纖維Fig.2 Schematic illustration of aligned fiber produced by electrospinning. (a)Columnar collectors method; (b)Incorporating auxiliary electrodes method

2.2 大孔徑纖維結(jié)構(gòu)

靜電紡纖維支架的小尺寸傾向所帶來的孔徑過小的現(xiàn)象會限制細胞在支架內(nèi)遷移。為克服這個問題，常見的方法是利用鹽浸漬法的原理，在制備雙組分支架后去除單個組分，以產(chǎn)生多孔構(gòu)造[49-50]，但是這種方法易受到另一個組分浸出的影響，而且支架的穩(wěn)定性在浸出后發(fā)生變化。改用液體收集裝置進行靜電紡，也可形成大孔徑的三維纖維支架(見圖3)。相比于空氣，纖維在液體中的沉積密度降低，從而形成較大的孔隙[11]。Lin等將滾筒收集裝置一半浸于水中，經(jīng)過靜電紡制備出三維取向的聚L-乳酸/聚丙烯腈(Poly(L-lactide)/Polyacrylonitrile，PLLA/PAN)復(fù)合支架，這使得在該支架上面培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞(hMSC)的增殖和存活力顯著改善[51]。

圖3 采用液體收集裝置的靜電紡示意。(a)制備隨機多孔纖維支架；(b)制備取向多孔纖維支架Fig.3 Schematic illustration of liquid-collecting electrospinning setups. (a)Production of random fibrous scaffold; (b)Production of aligned fibrous scaffold

除了改變接收裝置外，制備多孔支架的另外一種方法是結(jié)合其他技術(shù)，如激光。利用高激光能量引起纖維的快速加熱、熔化和蒸發(fā)，在靜電紡纖維上產(chǎn)生期望的幾何圖案，如凹槽或基質(zhì)孔[52]。Javier等在制備含有納米羥基磷灰石的PCL纖維膜上用激光處理，產(chǎn)生了70～100 μm的孔洞，提高了其生物活性[53]。

除此之外，通過使用更高的聚合物濃度或改變?nèi)軇┙M成、增加纖維直徑來擴大孔徑的方法也是非常普遍的[50, 54]。纖維直徑的增加雖然擴大了支架的孔隙率以促進細胞浸潤，但可能對細胞附著和生長具有負面影響。為此，Wu等利用動態(tài)液體系統(tǒng)和雙噴嘴共同靜電紡兩種技術(shù)，制備由納米纖維聚集而成的靜電紡紗線(直徑為10～19 μm)，這種靜電紡紗線與納米纖維相比具有更好的機械性能、更高的孔隙率和更大的孔徑，促進了平滑肌細胞的增殖和遷移[55]。

2.3 多尺度復(fù)合結(jié)構(gòu)

在多尺度纖維支架中，納米尺度的纖維可以為細胞附著和生長提供了有利的表面形態(tài)，而微米尺度的纖維能夠為細胞遷移提供足夠的空間，同時也可增強支架的力學(xué)性能，成為組織工程支架的新型設(shè)計方向。多尺度復(fù)合結(jié)構(gòu)支架主要通過兩種及以上技術(shù)配合進行設(shè)計，比如溶液靜電紡與熔融靜電紡的結(jié)合，還有三維(3D)生物印刷技術(shù)與靜電紡的結(jié)合來制備新型3D支架。

熔融靜電紡雖然應(yīng)用不廣，但是紡絲體系中不含有溶劑，不存在溶劑揮發(fā)不干凈的問題，所以溶液與熔體靜電紡絲的組合在制備多尺度復(fù)合結(jié)構(gòu)支架方面具有一定的優(yōu)勢。Kim等將裝有聚合物溶液及聚合物熔體的兩個噴絲頭安放在相對的位置上，面向同一個接收裝置同時紡絲，制備出多尺度PLGA復(fù)合支架，在人表皮成纖維細胞(NHEF)和人表皮角化細胞(NHEK)相容性評價中，復(fù)合結(jié)構(gòu)支架比微米級支架更能促進細胞的增長[56]。

3D打印是一種利用添加劑等材料快速定型的技術(shù)，可以在微米范圍內(nèi)制造出可調(diào)控的、復(fù)雜的個性化支架，常用的幾種3D打印包括生物繪圖(bioplotting)、噴墨生物印刷(inkjet bioprinting)、選擇性激光照射(selective laser sintering, SLS)、立體光刻(stereolithography, SL)和熔融沉積建模(fused deposition modeling, FDM)，已有學(xué)者對3D打印技術(shù)在組織再生領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述[57]。3D打印與靜電紡的結(jié)合，既可以實現(xiàn)個性化的支架設(shè)計，又可以利用納米纖維特性提高支架的生物相容性。Lee等利用立體光刻的方法，將PCL納米纖維嵌入到3D印刷水凝膠支架中，結(jié)果表明與無納米纖維支架相比，復(fù)合結(jié)構(gòu)支架明顯改善了神經(jīng)干細胞的黏附，同時具有取向結(jié)構(gòu)的復(fù)合結(jié)構(gòu)支架增強了細胞的增殖[58]。

利用具有圖案化表面的接收裝置，在電場分布環(huán)境下可以相應(yīng)地影響纖維沉積，制備出獨特的纖維結(jié)構(gòu)(見圖4)，會產(chǎn)生更好的機械強度并誘導(dǎo)特異性細胞反應(yīng)[59]。Mahjour等在靜電紡絲過程中將含膠原的電紡絲納米纖維收集到不銹鋼金屬網(wǎng)的表面上，制備出纖維密度從密集到松散分布、周期性交替的纖維支架，其中密集區(qū)域內(nèi)的纖維保持結(jié)構(gòu)完整性，而松散分布區(qū)域內(nèi)允許細胞穿透，改善了細胞的擴散[60]。同時，纖維密集區(qū)域和松散的纖維區(qū)域之間的不同纖維結(jié)構(gòu)也誘導(dǎo)成纖維細胞的不同形態(tài)(星狀與細長的紡錘狀)。采取不同圖案的模板也可以制備出不同的形狀的支架[61]，為支架的設(shè)計提供了新的思路。

圖4 模板接收裝置靜電紡示意Fig.4 Schematic illustration of pattern-collecting electrospinning process

3 結(jié)論與展望

通過靜電紡技術(shù)制備出纖維型支架，可以模擬天然ECM的結(jié)構(gòu)特點，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。本文綜述了不同纖維支架結(jié)構(gòu)對細胞行為的影響，具有類似于ECM纖維尺寸的支架可以增強細胞的黏附和增殖，同時不同大小的孔徑、不同的空間排列也會影響細胞形態(tài)、分化、遷移等行為。但是，限于現(xiàn)有靜電紡等制備技術(shù)的發(fā)展水平，難以得到精確控制的支架結(jié)構(gòu)；同時細胞具有自己獨特的性能，對不同材料、不同尺度的纖維響應(yīng)不同，這使得更加細致、深入的研究面臨巨大的困難。

總而言之，纖維支架與細胞相互作用機制的研究不僅可以為支架的設(shè)計提供新思路，而且還可以通過與其他因素結(jié)合來調(diào)控細胞活動。例如，結(jié)合材料的化學(xué)性質(zhì)設(shè)計出更大應(yīng)用規(guī)模的組織工程支架，這對組織再生領(lǐng)域的推進極為有利，同時還可以促進它在新材料以及生物傳感器等領(lǐng)域的發(fā)展。