海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生1)

楊秀蓮 胡蝶 宋佳妮 王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

海州常山(Clerodendrumtrichotomum)，馬鞭草科大青屬，落葉灌木或小喬木，葉片大呈心形且具有特殊氣味，又稱臭梧桐[1]；在我國廣泛分布，國外如日本、朝鮮及菲律賓北部也有分布[2]。海州常山形態(tài)為白花、紅萼、藍果，且花萼形狀奇特，呈五角形，花果期長達半年，是夏季觀花、秋季觀果賞萼的優(yōu)良樹種[3]。海州常山對不良環(huán)境有很強的耐受和抵抗能力，可用于鹽堿地區(qū)及礦區(qū)等土地條件惡劣地區(qū)的綠化[4]；其枝葉含有可以殺滅紅蜘蛛、棉蚜蟲和地下害蟲的化學(xué)物質(zhì)[5]，種子的含油量也很高，可在制備生物農(nóng)藥、開發(fā)生物柴油等新能源的領(lǐng)域進行研究和推廣[6-7]。綜上，海州常山具有很高的研究價值和很好的應(yīng)用開發(fā)前景，可在城市園林綠化中進行廣泛推廣[8-11]。

海州常山常生長于山坡、野地等地方，前人對其研究較晚，現(xiàn)今栽培應(yīng)用的還很少。目前針對海州常山的研究大都集中在抗逆性以及莖葉有效化學(xué)成分和藥理作用方面，對繁殖技術(shù)的研究主要集中在扦插和分株繁殖[12]上，組培快繁方面的研究較少，現(xiàn)只見宋婷等[13]、姜麗瓊等[14]和包崢焱[15]用海州常山莖段作為外植體進行快繁的研究，未見有外植體經(jīng)歷脫分化、再分化間接形成完整植株的報道。本研究以海州常山嫩葉為外植體，從消毒方法、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件、植物生長調(diào)節(jié)劑配方等方面，對海州常山葉片愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化進行探討，以期建立高效的離體再生技術(shù)體系，彌補海州常山完整組培體系的空缺，為種質(zhì)資源的保護及規(guī)模化生產(chǎn)提供參考，也為后續(xù)的細胞或分子水平的研究提供基本的試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

材料采自南京林業(yè)大學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心海州常山鹽城種源1年生扦插苗，選取健康、無病蟲害的新梢嫩葉為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌體系的建立

葉片先用加有洗潔精的水清洗，毛刷輕刷去葉面上的雜質(zhì)后放在流水下沖洗1 h。預(yù)處理后，將葉片放置超凈工作臺，用75%酒精表面滅菌30 s，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%的HgCl2或5%的NaClO溶液分別進行1、3、5、7 min的表面滅菌，無菌水沖洗5～6次，最后將嫩葉切成0.5 cm2大小的方塊，接種于添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，同時添加7.0 g·L-1瓊脂和30 g·L-1蔗糖，以下均同。每個處理接種15瓶，每瓶3塊四周具有切口的葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計外植體污染率、死亡率和存活率。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基的篩選

用最佳的消毒方法對葉片消毒后，將其切成0.5 cm2大小的方塊，接種到添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS、1/2 MS、WPM和B5四種不同基本培養(yǎng)基上。每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織形成率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)光暗條件篩選

將葉片接種在添加2.0 mg·L-1BA和0.1 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基上，分別進行光暗交替培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織形成率、褐化率和愈傷組織生長狀況。

光暗交替培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照強度2 000 Lx左右，光照時間14 h·d-1。

暗培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，無光照。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

根據(jù)上述試驗結(jié)果，在最適培養(yǎng)基上進行激素(6-BA+NAA)的篩選，其中6-BA的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5 mg·L-1，每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。觀察其愈傷組織誘導(dǎo)及生長情況，30 d后統(tǒng)計褐化率和愈傷組織形成率。

1.2.5 愈傷組織増殖植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

將初代培養(yǎng)獲得的色澤透明淺綠、結(jié)構(gòu)較致密的愈傷組織切塊接種于MS培養(yǎng)基中。設(shè)置原誘導(dǎo)愈傷組織效果最好培養(yǎng)基中的激素處理組合為第1種處理，第2種處理將第1種處理中生長素(NAA)的質(zhì)量濃度降低一半，第3種處理將第1種處理中的生長素(NAA)質(zhì)量濃度升高一倍，第4種處理不添加任何生長調(diào)節(jié)劑作為對照(表1)。每個處理接種15瓶，每瓶3塊葉片，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，暗培養(yǎng)。20 d后統(tǒng)計各處理的愈傷組織的增殖情況。

表1 愈傷組織增殖植物生長調(diào)節(jié)劑配方

1.2.6 愈傷組織分化植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

將愈傷組織切塊接種于MS培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)。其中6-BA質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度為0、0.05、0.10 mg·L-1，共6種組合。每個處理接種15瓶，每瓶3塊愈傷組織，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件為溫度(25±2)℃，光照強度2 000 lx左右，光照時間14 h·d-1。30 d后統(tǒng)計各處理的愈傷組織的增殖分化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 20010統(tǒng)計匯總后，利用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析。

試驗主要統(tǒng)計指標(biāo)有：

污染率=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

死亡率=(死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

存活率=(存活的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

愈傷組織形成率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

褐化率=(褐化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

增殖率=(愈傷組織體積增大未褐化的數(shù)量/接種的愈傷組織總數(shù))×100%；

分化率=(產(chǎn)生芽點分化出芽苗的愈傷組織數(shù)量/接種的愈傷組織總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌體系的建立

由表2可知，隨著消毒時間的加長，外植體污染率呈現(xiàn)下降的趨勢，而死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢，存活率先上升后下降。用0.1% HgCl2滅菌7 min時，外植體污染率達到最低，為6.67%，死亡率達到最高，為57.78%。存活率在消毒5 min時最高，為64.44%，此時，外植體污染率和死亡率分別為22.22%和13.33%。0.1% HgCl2處理下，滅菌5 min后，外植體死亡率顯著降低。5% NaClO滅菌時總體上效果比0.1% HgCl2處理差。滅菌7 min，外植體污染率達到最低，為15.56%，死亡率達到最高，為51.11%，存活率在消毒3 min時最高，為42.22%，此時外植體污染率和死亡率分別為42.22%和15.56%。綜合來看，0.1% HgCl2滅菌5 min，存活率最高，污染率和死亡率也相對較低，因此，對于海州常山的嫩葉來說，最佳的表面滅菌方法是，先用75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，0.1% HgCl2溶液處理5 min，無菌水沖洗5～6次。

表2 不同消毒方法對葉片表面滅菌效果的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同一滅菌劑不同滅菌時間時，同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.2.1 不同基本培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，B5和1/2 MS培養(yǎng)基的愈傷組織形成率較低，分別為6.67%和15.56%，與MS和WPM培養(yǎng)基的愈傷組織形成率呈極顯著差異(P<0.01)。MS、WPM培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，同為37.78%，但MS基本培養(yǎng)基測定結(jié)果3次重復(fù)間的偏差值更小，結(jié)果更穩(wěn)定，所以海州常山葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

表3 不同基本培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 光暗條件篩選

光暗交替培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01)。外植體培養(yǎng)到15～20 d時，置于無光條件下培養(yǎng)的葉片開始卷曲(圖1A)，25 d開始出現(xiàn)愈傷組織，愈傷組織呈黃綠色或綠色，較疏松(圖1B)，愈傷組織形成率為44.35%，褐化率為53.23%。而置于光照條件下培養(yǎng)的葉片愈傷組織形成率為0，且褐化嚴重，褐化率高達84.44%，比暗培養(yǎng)高出31.21%(表4)。所以黑暗條件下培養(yǎng)更有利于海州常山葉片誘導(dǎo)愈傷組織。

A.接種20 d左右葉片開始出現(xiàn)卷曲；B.接種25 d葉片開始脫分化進入細胞分裂期；C.愈傷組織黃綠，體積略有增大，較緊實；D.愈傷組織增殖有結(jié)構(gòu)形狀生成，表面緊實顆粒狀但未分化；E.愈傷組織分化，葉片生長變薄，顏色變深；F.植株長勢良好，葉面紋路清晰，葉緣出現(xiàn)波狀齒；比例尺：0.5 mm。

圖1 海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

由表5可知，6-BA與NAA不同質(zhì)量濃度組合的8個處理中，處理1愈傷組織形成率最高，可達66.67%，褐化率最低，為28.89%，與其他7個處理差異顯著；其次為處理2和處理5愈傷組織形成率均可達37.78%，二者與處理4、6、8均無顯著差異；處理7的愈傷組織形成率效果最差，為4.44%，褐化率也是最高，為91.11%。6-BA為0.50 mg·L-1時愈傷組織形成率均較高，分別為66.67%和37.78%，6-BA質(zhì)量濃度升高后，愈傷組織形成率有所降低，說明在海州常山葉片愈傷組織的形成過程中，細胞分裂素6-BA在質(zhì)量濃度較低時起到促進作用。隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，其愈傷組織形成率并非呈現(xiàn)單純的上升或者下降趨勢，在與其搭配的NAA質(zhì)量濃度變化的共同作用下產(chǎn)生曲線的變化，說明對葉片誘導(dǎo)愈傷組織來說，生長素與細胞分裂素的比值比質(zhì)量濃度更重要。綜合愈傷組織的誘導(dǎo)率和褐化率分析結(jié)果，得出海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)配方為1號處理，即MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1。

表5 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.3 愈傷組織的増殖培養(yǎng)

從表6可知，在未添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，海州常山愈傷組織不生長并且發(fā)生褐化，而其他3個添加了激素的處理都出現(xiàn)了不同程度的增殖甚至是分化，這表明了在海州常山愈傷組織增殖過程中，添加外源生長調(diào)節(jié)劑能有效促進愈傷組織的增殖(圖1C)。在4種處理中，2號處理的愈傷組織增大最明顯，生長情況最佳，因此，海州常山愈傷組織增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)方案為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。

表6不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響

處理6-BA質(zhì)量濃度/mg·L-1NAA質(zhì)量濃度/mg·L-1愈傷組織平均大小/mm生長情況10.500.1010.86淡黃綠色體積,較致密20.500.0521.76綠色,較致密,有顆粒狀結(jié)構(gòu)30.500.2014.33黃綠色,較疏松4007.80不生長并且褐化

2.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)

從表7可知，將海州常山愈傷組織接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，有的生長調(diào)節(jié)劑處理下愈傷組織量有增加，顏色由淺綠色變黃綠色，表面有顆粒狀的小突起出現(xiàn)，但未出現(xiàn)分化(圖1D)，如處理2：6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，有的生長調(diào)節(jié)劑處理下愈傷組織量有增加并出現(xiàn)分化(圖1E)，如處理6：6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1。從試驗結(jié)果來看，增殖率和分化率最高的都是處理1，增殖率為55.56%，分化率為13.33%，處理1與處理2、3、5、6均達到差異顯著水平。故海州常山愈傷組織最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1。

表7 不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對愈傷組織分化的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異極顯著(P<0.01)；+生長勢差；++生長勢一般；+++生長勢良好。

繼續(xù)對不同質(zhì)量濃度NAA做多重對比(表8)，可以得出，海州常山葉片愈傷組織分化過程中不同質(zhì)量濃度NAA的處理均達到顯著水平，且低質(zhì)量濃度有利于愈傷組織的增殖和分化。由表6所得出的海州常山愈傷組織的最佳增殖培養(yǎng)基處理MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，在海州常山愈傷組織的分化培養(yǎng)中未能成功誘導(dǎo)分化，說明在該生長調(diào)節(jié)劑處理下增殖的愈傷組織是非胚性愈傷組織，即表7中的2號處理不適合愈傷組織分化培養(yǎng)。6號處理MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1，增殖率較高，達到42.22%，但分化率較低，僅6.67%，分化后芽苗的生長狀況較好，莖生長明顯，葉開展(圖1F)。由此可推測，6號處理不太適合愈傷組織的增殖分化培養(yǎng)，但可能適合用于后期莖段的初代培養(yǎng)或者不定芽增殖培養(yǎng)。

表8 不同質(zhì)量濃度NAA對增殖率、分化率的多重比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準差；同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)之一是建立無菌體系，外植體消毒方法的選擇至關(guān)重要[16]。外植體進行表面滅菌要選擇合適的滅菌劑及濃度、滅菌時間及操作順序，不同的植物種類、不同的外植體部位對同樣的表面滅菌過程的反應(yīng)有所差異，最終培養(yǎng)效果也會不同。常用的表面滅菌劑有0.1%的HgCl2、1%～10%的NaClO、1%的AgNO3等，無論是哪種表面滅菌劑，濃度太低時間太短，滅菌不徹底，外植體的污染率就得不到控制；濃度過高，時間過長，對植物造成的傷害太大，會導(dǎo)致外植體細胞的破壞及產(chǎn)生大量次生代謝物質(zhì)，進而使外植體產(chǎn)生褐化甚至死亡，降低外植體接種在培養(yǎng)基上后續(xù)培養(yǎng)的存活率，只有選用適宜的濃度和滅菌時間才能既消滅細菌又保持外植體的活性。本試驗中，5% NaClO和0.1% HgCl2滅菌時間太短(如1 min)無法控制污染，時間太長(如7 min)對于葉片有極強的毒害作用，死亡率升高。此外，還發(fā)現(xiàn)0.1% HgCl2溶液比5% NaClO溶液進行相同時間滅菌處理時，0.1% HgCl2的效果更好，周宇晴等[17]在試驗中也得出0.1% HgCl2效果優(yōu)于5% NaClO。本試驗最終得出適宜海州常山葉片最佳的消毒方法為75%酒精處理30 s，無菌水沖洗3～4次，再用0.1% HgCl2溶液處理5 min，無菌水沖洗5～6次，葉片的成活率最高，達到64.44%。

離體培養(yǎng)的成功與否與基本培養(yǎng)基的類型也息息相關(guān)。不同培養(yǎng)基中含有不同濃度的無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機附加物等物質(zhì)，造成培養(yǎng)效果不同。各種植物由于基因型不同適用于不同基本培養(yǎng)基，如棱角山礬葉片適用B5培養(yǎng)基[18]，珙桐[19]、懸鈴木[20]在WPM培養(yǎng)基長勢良好，本試驗選擇MS、1/2 MS、WPM和B5對海州常山的葉片進行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果得出，含有較高濃度硝酸鹽和NH4+的MS基本培養(yǎng)基為海州常山葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

不同光照條件也會影響植物愈傷組織的生長與發(fā)育。本試驗中暗培養(yǎng)時海州常山葉片愈傷組織的誘導(dǎo)率高，結(jié)構(gòu)較疏松，而光暗交替培養(yǎng)時愈傷組織結(jié)構(gòu)緊實，不利于分化。這與油桃[21]、毛桃[22]、薔薇[23]、膝柄木[24]和青錢柳[25]的研究結(jié)果相似，都認為暗培養(yǎng)有助于愈傷組織誘導(dǎo)。

愈傷組織誘導(dǎo)和分化也是植物組織培養(yǎng)中的兩個關(guān)鍵部分。愈傷組織是在外植體的受創(chuàng)面附近發(fā)生細胞加速分裂形成的無組織結(jié)構(gòu)的細胞群。愈傷組織生長情況的不同會影響后續(xù)的愈傷組織分化及成苗的培養(yǎng)效果，在試驗中，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及配比對愈傷組織誘導(dǎo)和分化會產(chǎn)生明顯的直接影響[26-27]。6-BA和NAA是愈傷組織誘導(dǎo)和分化中常用的兩種激素，陳穎[28]進行銀杏葉的愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，NAA與6-BA組合效果最好，本試驗也采用NAA與6-BA進行質(zhì)量濃度篩選。試驗結(jié)果顯示，細胞分裂素6-BA對海州常山愈傷組織形成率有極顯著的影響，且質(zhì)量濃度較低時(0.5 mg·L-1)起到促進作用，與Li et al.[29]和陳雪等[30]已報道的結(jié)果相似，較高質(zhì)量濃度的細胞分裂素阻礙愈傷組織的誘導(dǎo)；而低質(zhì)量濃度的生長素NAA(0.01 mg·L-1)有利于海州常山愈傷組織的分化，這與范小峰等[31]研究結(jié)果相似。木本植物進行愈傷組織增殖時，發(fā)現(xiàn)采用比愈傷組織誘導(dǎo)階段更低的生長素質(zhì)量濃度有利于愈傷組織的增殖[18,32]，本試驗也證實了這一點，愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.10 mg·L-1，愈傷組織最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。

本研究以海州常山的嫩葉作為外植體，進行愈傷組織的誘導(dǎo)和分化研究，以期為海州常山種質(zhì)資源的保護及規(guī)模化生產(chǎn)提供參考，也是為海州常山遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)，后續(xù)就如何克服愈傷組織的褐化，提高愈傷組織分化率和不定芽的生根及移栽還可進一步試驗研究。