侯姝芳 朱俊芳 陳燕 李慧珍 歐明林 眭維國(guó)*

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.中國(guó)人民解放軍第一八一醫(yī)院 腎臟科、全軍器官移植與透析治療中心、廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、桂林市腎臟病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541002)

地中海貧血(thalassemia)簡(jiǎn)稱(chēng)地貧，是一種血紅蛋白病，血紅蛋白是由珠蛋白和血紅素組成的四聚體。地貧發(fā)病的分子機(jī)制是珠蛋白基因突變導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)不足，引發(fā)α/β鏈比例失衡，失衡程度越大，溶血性貧血病情越重，其中以 α、β 地中海貧血最為常見(jiàn)。地貧屬于常見(jiàn)的出生缺陷之一，是可預(yù)防的常染色體隱形遺傳病，因此地貧防控是出生缺陷防控重點(diǎn)項(xiàng)目之一。研究地貧的致病基因、發(fā)病的分子機(jī)制和基因型與表型的對(duì)應(yīng)關(guān)系，是對(duì)地貧患者進(jìn)行分子診斷、對(duì)攜帶者夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷和提供遺傳咨詢(xún)的最重要依據(jù)。

該病多發(fā)于我國(guó)南方地區(qū)，但不同地域的地中海貧血發(fā)病率存在差別，其中貴州地區(qū)的地中海貧血基因陽(yáng)性檢出率為46.05%[1]，廣東云浮地區(qū)的發(fā)病率約11.26%，廣東深圳地區(qū)的地中海貧血基因陽(yáng)性檢出率為7.9%[2]，福建省約4.41%[3]。廣西是我國(guó)地貧攜帶率最高的地區(qū)，每4個(gè)人有1個(gè)地貧攜帶者。本研究對(duì)8757例受檢者地中海貧血篩查進(jìn)行基因型分析和研究，為本地區(qū)地中海貧血的臨床診斷及優(yōu)生優(yōu)育提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2016年8月至2017年10月于中國(guó)人民解放軍第一八一醫(yī)院進(jìn)行地中海貧血篩查的8757例受檢者為研究對(duì)象。研究對(duì)象主要分為以下幾類(lèi)：①于本院進(jìn)行優(yōu)生遺傳咨詢(xún)的受檢者；②紅細(xì)胞平均體積(erythrocyte mean corpuscular volume，MCV)<80fl，平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)<28pg的門(mén)診及住院患者；③于本院進(jìn)行產(chǎn)前篩查的產(chǎn)婦；④于本院體檢中心進(jìn)行健康體檢的體檢者。其中男性受檢者4366例，女性受檢者4391例，年齡為3個(gè)月至52歲。本實(shí)驗(yàn)研究遵循的程序符合中國(guó)人民解放軍第一八一醫(yī)院倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得受試對(duì)象本人的知情同意，并與之簽署臨床研究知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取方法 所有受檢者均采集肘靜脈血2ml，至于EDTA-K2抗凝管?；蚪MDNA的提取采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司提供的全基因組DNA提取試劑(玻璃粉法)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)操作。

1.2.2 常見(jiàn)基因型診斷 采用跨越斷裂位點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)(多重GaP-PCR)技術(shù)進(jìn)行常見(jiàn)的4種缺失型α地中海貧血(--SEA/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--THAI/αα)的檢測(cè)；并采用反向斑點(diǎn)雜交法(reverse dot blot，RDB)技術(shù)進(jìn)行常見(jiàn)3種非缺失α地中海貧血點(diǎn)突變(αWS、αQS、αCS)及17種CD41/42(-TTCT)、CD43(G-T)、IVS- Ⅱ-654(C-T)、CD71/72(+A)、CD17(A-T)、β-28(A-G)、IVS-I-1(G-T，G-A)、IVS-I-5(G-C)、-30(T-C)、CD31(-C)、CD27/28(+C)、-32(G-A)、-29(A-G)、Cap(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)以及βE(G-A)基因檢測(cè)。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體相關(guān)檢測(cè)，試劑盒由深圳益生堂生物公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 本研究數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理。樣本量估算方法采用Ssize軟件，確定滿(mǎn)足本研究統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的最小樣本量。樣本中陽(yáng)性檢出例數(shù)采用直接計(jì)數(shù)法，構(gòu)成比采用百分比(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 α地中海貧血 患者常見(jiàn)基因型分布情況在8757例受檢者中通過(guò)常見(jiàn)的基因型分析，確診地中海貧血為1782例，檢出的陽(yáng)性率為20.3%(1782/8757)。確診的α地中海貧血為1189例，占66.7%(1189/1782)，其中包括550例α地中海貧血1基因型，占46.2%(550/1189)；550例α地中海貧血2基因型，占49.4%(588/1189)；41例HbH病基因型，占3.4%(41/1189)。

1189例α地中海貧血患者中所占比例最高的是東南亞缺失型(--SEA/αα)，為44.66%(531/1189)；其次是α地中海貧血2基因型(-α3.7/αα)占25.9%(308/1189)；再次是α地中海貧血2基因型(-α4.2/αα)占8.83%(105/1189)。在α地中海貧血2基因型中檢出的基因型αCSα/αCSα為α地中海貧血中的非缺失型中的純合子，較為少見(jiàn)。HbH基因型主要包括以下5種類(lèi)型：--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、--SEA/αWSα、--SEA/αCSα、--SEA/αQSα，見(jiàn)表1。

表1 1189例α地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 β地中海貧血患者常見(jiàn)基因型分布情況(表2)

表2 528例β-地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果

確診的528例β地中海貧血，占30%(528/1782)，均為β雜合子基因型，在528例β地中海貧血患者中，其中βCD41-42/βN的基因型比例最高，為47.54%(251/528)，其次為βCD17/βN占21.02%，βCD31/βN、βCAPM/βN、βIVS-Ⅰ-1/βN以上3種地中海貧血基因型所占比例最少均為0.19%(1/528)，見(jiàn)表2。

2.3 β復(fù)合α地中海貧血患者常見(jiàn)基因型分布情況(表3)

表3 41例β復(fù)合α地中海貧血患者基因型檢測(cè)結(jié)果[例(%)]

在1782例確診為地中海貧血為陽(yáng)性的受檢者本研究共檢出β復(fù)合α地中海貧血基因型共41例，占0.02%(41/1782)。其中19例β復(fù)合--SEA/αα的基因型，占 46.43%(19/41)，15例β復(fù)合-α3.7/αα，占36.59%(15/41)，并且檢出β雙重雜合子βIVSⅡ-654/βEM復(fù)合--SEA/-α3.7、βCD41-42/βIVS-Ⅱ-654復(fù)合-α3.7/αα各1例，所占比例均為2.44%(1/41)，見(jiàn)表3。

3 討論

全球遺傳流行病學(xué)研究顯示，全球約3.5億人(2%)是地中海貧血基因攜帶者，預(yù)計(jì)每年33.6萬(wàn)的新生患兒患有血紅蛋白病。塞浦路斯遺傳流行病學(xué)研究顯示，14%的塞浦路斯人是地中海貧血的攜帶者，預(yù)計(jì)每年每出生192例新生兒就有1例為地貧純合子，如果沒(méi)有有效的預(yù)防，從1971～2010年，該國(guó)地貧患病率從1∶1000增加至1∶138，由于塞浦路斯迅速建立國(guó)家防控計(jì)劃，其地貧出生人口顯著降低。根據(jù)廣西遺傳流行病學(xué)研究顯示，約1∶4是地中海貧血基因攜帶者，預(yù)計(jì)每230個(gè)胎兒就有一個(gè)重型地貧患者，因此在廣西開(kāi)展地貧的大規(guī)模人群干預(yù)十分必要，提高人口素質(zhì)，減少地貧患兒的出生，為家庭和社會(huì)減輕由于地貧患兒帶來(lái)的沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)有十分重要的意義。

本研究對(duì)桂林地區(qū)8757例地中海貧血篩查受檢者進(jìn)行地貧基因型檢查，初篩的陽(yáng)性率為20.3%(1782/8757)，低于貴州地區(qū)的地中海貧血基因陽(yáng)性檢出率(46.05%)[1]，但遠(yuǎn)高于李云珠[2]等對(duì)廣東深圳地區(qū)人群的研究結(jié)果[7.9%(2194/12960)]。由表1可見(jiàn)，地中海貧血以地中海貧血1基因型為主(46.26%，550/1189)與廣東茂名地區(qū)人群的研究結(jié)果相比略低[4]。在α地中海貧血2基因型中檢出的基因型αCSα/αCSα在廣東茂名地區(qū)人群中未檢出。由此可見(jiàn)，廣西地區(qū)地中海貧血的基因類(lèi)型較為豐富。

β地中海貧血是由于血紅蛋白的-珠蛋白鏈合成減少或缺失，危害最為嚴(yán)重的遺傳性溶血性貧血。廣西地區(qū)人群β-地貧基因攜帶率為6.78%[5]，本研究結(jié)果顯示桂林地區(qū)β-地貧基因攜帶率為6.15%(528/8587)，在528例β-地中海貧血患者中，其中βCD41-42/βN的基因型比例最高，為47.54%(251/528)，其次為βCD17/βN占21.02%，與貴陽(yáng)和重慶地區(qū)有較大差別，貴陽(yáng)和重慶地區(qū)以βCD17/βN為主。本研究中，β復(fù)合α地中海貧血基因型共41例，占0.02%(41/1782)該結(jié)果低于廣東地區(qū)的檢出率8.6%[6-7]。以基因型βCD41-42/βN復(fù)合--SEA/αα為主，與廣西地區(qū)有相似的結(jié)果。由此可見(jiàn)，桂林地區(qū)地中海貧血基因型具有獨(dú)特的分布特征，本研究結(jié)果為該地區(qū)育齡人群做好婚前、孕前及孕期地中海貧血的篩查及基因診斷提供參考依據(jù)。

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