橫根費菜不同溶劑萃取部位止癢抗炎作用研究

韓寧娟，方歡樂，牛 睿，劉倩妮，于晉茹，劉利兵

(西安培華學院醫(yī)學院，西安 710125)

皮膚瘙癢是皮炎、濕疹和蕁麻疹等皮膚疾病常見的臨床表現(xiàn)，瘙癢發(fā)生的機制尚不明確，可能由多種化學物質引起，如組胺和前列腺素等[1]。橫根費菜(SedumkamtschaticumFish)又名金不換、北景天等，為景天科景天屬多年生草本植物，具有活血、止血、消腫和解毒的功效，主治蚊蟲叮咬、癰腫和跌打損傷等，有很好的食用、藥用價值?，F(xiàn)代研究表明，橫根費菜的主要成分是酚酸類、黃酮類和生物堿等[2-3]。民間用其新鮮汁液治療蚊蟲叮咬后引起的瘙癢，效果顯著[4]。文獻報道，景天科景天屬植物的黃酮類成分具有抗炎、止癢作用[5-6]。本研究采用右旋糖酐致小鼠瘙癢模型和二甲苯致小鼠耳腫脹模型，從止癢、抗炎兩方面觀察橫根費菜不同極性溶劑萃取部位的藥效，將橫根費菜開發(fā)為天然止癢抗炎產(chǎn)品，為其臨床應用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 UV-2102紫外-可見分光光度計，F(xiàn)A1004電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；游標卡尺(0～150 mm，杭州杭工量具制造有限公司)。

1.2試藥 橫根費菜(采自陜西省咸陽市，經(jīng)西安交通大學生藥學徐文友教授鑒定)；右旋糖酐40葡萄糖注射液(新疆制藥廠，批準文號：國藥準字H20033280)；復方醋酸曲安奈德溶液(廣東恒誠制藥有限公司，批準文號：國藥準字H10930202)；膚得安凝膠(沈陽康氏醫(yī)藥保健品有限公司，批準文號:遼衛(wèi)消證字2002第0043號)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)醫(yī)藥有限公司，批準文號：國藥準字S10870001)；其他試劑均為分析純。

1.3動物 昆明種小鼠由空軍軍醫(yī)大學動物中心提供，合格證號：SCCK(軍)2012-0007。

2 方法

2.1橫根費菜不同極性溶劑萃取部位的制備 取橫根費菜適量，粉碎，按照料液比1∶5加入體積分數(shù)為75%的乙醇，回流1 h，過濾，將濾渣再用體積分數(shù)為75%的乙醇回流提取2次，過濾，將2次濾液合并，減壓濃縮成浸膏，真空干燥，可得橫根費菜乙醇提取物。稱取一定質量的乙醇提取物，用適量蒸餾水溶解，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取3次，將所得萃取液合并后減壓濃縮成浸膏，真空干燥，可得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位，密閉盛放在消毒處理的玻璃瓶內，4 ℃保存[7-8]。臨用前，用生理鹽水將橫根費菜乙醇提取物及不同極性溶劑萃取部位溶解，制得橫根費菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位(藥液1 mL均相當于生藥1 g)。

2.2不同極性溶劑萃取部位總黃酮含量的測定 參考文獻方法[9-10]，準確稱取蘆丁對照品5.00 mg，用體積分數(shù)為75%的乙醇溶解，移至25 mL量瓶中定容，即得質量濃度為0.2 mg·mL-1的對照品溶液。分別量取對照品溶液0，0.2，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，1.8和2.0 mL，置于5 mL量瓶中，加0.15 mL質量濃度為0.11 g·mL-1的亞硝酸鈉水溶液，搖勻，放置6 min；加0.15 mL質量濃度為0.03 g·mL-1的硝酸鋁，搖勻，放置6 min；加2.00 mL質量濃度為0.8×106g·mL-1的氫氧化鈉，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min。于波長510 nm處測定吸光度值。用無水乙醇做空白實驗。繪制標準曲線，得回歸方程為：y=12.325x+0.004 25，r=0.999 5。

橫根費菜乙醇提取液和不同極性溶劑萃取部位總黃酮含量的測定：吸取各組分溶液1 mL，按照繪制標準曲線的方法測定吸光度值A，結果以橫根費菜中含有相當于蘆丁的質量表示，單位為mg·g-1。

橫根費菜中總黃酮的含量(mg·g-1)=(y×V)/(V0×m)

y為標準曲線計算出的質量濃度(mg·mL-1)；V為提取液的總體積(mL)；V0為加樣體積(mL)；m為橫根費菜質量(g)。

2.3橫根費菜對右旋糖酐誘發(fā)小鼠皮膚瘙癢模型的影響 依據(jù)文獻記錄方法制備小鼠皮膚瘙癢模型，取小鼠70只，隨機均分為7組，設模型組(生理鹽水)、陽性對照組(膚得安)、橫根費菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各組小鼠右后足背部剃毛2 cm×2 cm，分別將給藥組或模型組按照0.1 mL·cm-2均勻涂于剃毛區(qū)，涂抹膚得安藥膏厚度為2 mm (相當于0.3 g·cm-2)，于末次給藥30 min后，小鼠尾靜脈注射質量濃度為12.8 mg·L-1的右旋糖酐0.01 mg。瘙癢指標為小鼠開始搔抓頭部和軀干，嘴咬全身。記錄30 min內小鼠搔癢次數(shù)和搔癢持續(xù)時間。

2.4橫根費菜對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹模型的影響 依據(jù)文獻記錄方法[11-12]制備小鼠耳廓腫脹模型，小鼠70只，分組同2.2項下。各組小鼠分別在實驗當日按照0.1 mL·cm-2右側耳廓涂藥1次，模型組涂以等容量的生理鹽水溶液，陽性對照組涂抹曲安奈德藥膏厚度為2 mm (相當于0.3 mg·cm-2)。1 h后各組用蒸餾水洗去藥液，棉球擦凈；給小鼠右耳涂二甲苯20 μL·只-1，左耳作對照。15 min后斷頸處死動物，沿耳廓基線剪下雙耳，在左右耳相同位置用6 mm角膜環(huán)鉆沖下耳片，精密稱定質量，計算腫脹度并求出腫脹抑制率。

腫脹度(mg)=右耳耳片質量(mg)-左耳耳片質量 (mg)

腫脹抑制率=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)÷模型組平均腫脹度×100%

2.5檢測不同樣品炎癥因子的比較 采取經(jīng)過建立模型各組小鼠的血液2 mL，進行生化檢驗，主要檢測腫瘤壞死因子(TNF-β)、白介素-6(IL-6)和一氧化碳(NO)，各指標檢測均嚴格按照實驗或相應試劑盒要求步驟進行。

3 結果與分析

3.1橫根費菜不同極性萃取部位中總黃酮含量的測定 測定橫根費菜提取物和不同極性萃取部位中總黃酮的含量，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位分別為7.65%，1.25%，13.50%，3.75%和0.75%，乙酸乙酯層中總黃酮含量最高。

3.2橫根費菜不同萃取部位對小鼠皮膚瘙癢的影響 與模型組比較，橫根費菜乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能顯著減少右旋糖酐致小鼠瘙癢次數(shù)、縮短瘙癢持續(xù)時間、具有止癢作用。橫根費菜乙酸乙酯部位止癢作用最優(yōu)。見表1。

表1橫根費菜不同極性部位對小鼠皮膚瘙癢的影響

樣品劑量/g·cm-2瘙癢次數(shù)/次瘙癢持續(xù)時間/s模型組-52.40±9.70344.81±90.24陽性對照組0.328.96±8.25** 205.61±66.95**橫根費菜乙醇提取物0.126.48±9.62**204.51±74.18**石油醚部位0.150.78±10.25301.24±72.18乙酸乙酯部位0.118.38±7.65** 139.24±65.38**正丁醇部位0.139.06±9.12*253.25±84.76*水部位0.149.40±10.70343.25±103.48

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.3橫根費菜不同萃取部位對小鼠耳廓腫脹的影響 見表2。由表2可知，與模型組比較，橫根費菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位對二甲苯引起的耳廊腫脹均具有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取部位作用最優(yōu)。

3.4橫根費菜不同極性萃取部位對炎癥因子的影響 各組TNF-β、IL-6和NO等炎癥因子水平均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中模型組TNF-β、IL-6和NO表達水平最高，見表3。

表2橫根費菜不同極性部位對小鼠耳廓腫脹的影響

組別劑量/g·cm-2腫脹度/mg腫脹抑制率/%模型組-1.92±0.31-陽性對照組0.0031.22±0.15**36.44橫根費菜乙醇提取物0.11.41±0.34**26.65石油醚部位0.11.89±0.212.47乙酸乙酯部位0.11.24±0.47**34.42正丁醇部位0.11.68±0.31*15.71水部位0.11.90±0.421.23

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3橫根費菜不同極性溶劑萃取部位對炎癥因子的影響

注：與對照組比較*P<0.05。

4 討論

本實驗通過用乙醇提取橫根費菜后，采用石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位進行萃取，觀察萃取物對右旋糖酐引起皮膚瘙癢的抑制作用和對二甲苯誘發(fā)的小鼠耳廊腫脹的抑制作用，測定各組分的總黃酮含量[13]。結果表明，橫根費菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位中黃酮的含量高低與止癢、抗炎效果平行，乙酸乙酯部位中總黃酮含量最高，止癢抗炎效果最好。水部位中總黃酮含量最低，幾乎無抗炎作用。此外，本文通過對相關的炎癥監(jiān)測顯示各組TNF-β、IL-6和NO等炎癥因子水平均高于對照組，其中模型組TNF-β、IL-6和NO表達水平最高，說明經(jīng)過藥物干預后炎癥因子均降低，具有一定的效果，其中水部位的效果更明顯，目前炎癥介質刺激法和化學物質刺激法是瘙癢模型較為常用的建立方法。右旋糖酐致小鼠瘙癢模型癥狀與臨床接近，不會引起其他繼發(fā)反應，通過瘙癢次數(shù)可直觀反映小鼠的瘙癢情況[14-15]。二甲苯作為急性炎癥動物模型常用的致炎劑，其致炎機制與臨床常見急性炎癥相似。二甲苯致小鼠耳廊腫脹模型見效快、復制成功率高，因此，本實驗選取右旋糖酐致小鼠皮膚瘙癢模型和二甲苯致小鼠耳腫模型用于研究橫根費菜的止癢、抗炎作用。

相關文獻資料[16]顯示，橫根費菜為多年生草本，根狀莖木質，橫生有分枝，葉上、下表皮細胞垂周壁呈波狀彎曲，邊緣微成波狀 ,細胞壁角質化增厚；均有氣孔，葉上表皮氣孔不等式較多，葉下表皮氣孔類型多為不等式[17]、環(huán)式，目前臨床對于該植物的藥物研究以及藥物分離較少見，下一步可將乙酸乙酯部位作為研究重點，采用色譜方法對其進行分離純化，跟蹤各分離組分的止癢、抗炎作用，提取分離出橫根費菜中止癢、抗炎活性成分并鑒定其結構，探明橫根費菜的止癢抗炎作用機制[18-19]?？傊?，橫根費菜乙酸乙酯部位止癢、抗炎的作用最優(yōu)，且總黃酮含量最高，這說明橫根費菜的止癢抗炎作用與總黃酮的含量有關。