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    黃精速溶粉抗氧化活性及對(duì)氧化損傷小鼠的保護(hù)作用

    2018-07-23 08:33:26伏有為李彥妮陳文軍
    食品研究與開發(fā) 2018年14期
    關(guān)鍵詞:黃精活力乙醇

    伏有為,李彥妮,陳文軍

    (安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,安徽合肥230032)

    黃精為百合科多年生草本植物黃精(Polygonatum sibricum Red.)、滇黃精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)或多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)的干燥根莖[1]。黃精始載于晉代《名醫(yī)別錄》,具有滋陰潤(rùn)肺、健脾益腎等作用,同時(shí)也是我國(guó)衛(wèi)計(jì)委公布的藥食同源植物之一?,F(xiàn)代研究顯示,黃精具有抗氧化、降血糖、改善學(xué)習(xí)記憶、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。乙醇進(jìn)入機(jī)體后主要在肝臟內(nèi)氧化代謝并產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),致使機(jī)體氧化還原失衡,誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、炎性細(xì)胞因子釋放和肝細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn),黃精可通過提高小鼠肝臟的抗氧化水平,對(duì)四氯化碳所致化學(xué)性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用[4],然而黃精對(duì)乙醇所誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷是否有保護(hù)作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見明確報(bào)道。鑒于此,本文采用經(jīng)五蒸五曬、打漿、蒸餾、霧化、固化等技術(shù)制得的黃精速溶粉(polygonatum sibricum instant powder,PSIP)作為研究對(duì)象,首先研究其體外抗氧化活性,然后以急性乙醇暴露致肝臟氧化損傷小鼠為模型,進(jìn)一步探究黃精速溶粉的體內(nèi)抗氧化活性和對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用,以期為深度開發(fā)利用黃精奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 藥物及試劑

    黃精速溶粉(20170308):安徽精天有限公司;谷丙轉(zhuǎn) 氨 酶 (alanine aminotransferase,ALT) 試 劑 盒(20171014)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)試劑盒(20171018)、甘油三酯(triglyceride,TG)試劑盒(20171014)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒(20170509)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒(20170518)、BCA 法蛋白定量試劑盒(20170520):南京建成生物工程研究所;2,4-二硝基苯肼(20130510):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫酸鏈霉素(E22811C251)、鹽酸胍(EZ2811D335):德國(guó)Biofroxx公司;二硫雙基苯甲酸(Y16M8K30650):上海源葉生物科技有限公司。

    1.2 儀器

    Synergy H4全功能酶標(biāo)儀:美國(guó)伯騰儀器公司;UV-1200紫外分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司;ME104E電子天平:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;Bullet Blender組織細(xì)胞破碎儀:美國(guó)Next Advance公司;立式超低溫保存箱:青島海爾特種電器有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

    昆明種雄性 8周齡 SPF 級(jí)小鼠,體重(40±2)g:北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。舒克貝塔牌SPF級(jí)小鼠維持糧(總能量3 616 kcal/kg,三大營(yíng)養(yǎng)素供能比為蛋白質(zhì)20.6%,脂肪12.0%,碳水化合物67.4%):江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

    2 方法

    2.1 PSIP體外抗氧化活性研究

    2.1.1 PSIP清除超氧陰離子自由基活性

    參考文獻(xiàn)[4-5]的方法,在10 mL比色管中加入0.05 mol/L Tric-HCl(pH=8.2)緩沖液4.5 mL,置于25℃水浴中預(yù)熱20 min,依次加入不同質(zhì)量濃度的PSIP溶液2 mL、25 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL,混勻,25℃水浴中反應(yīng)5 min(從加入鄰苯三酚開始計(jì)時(shí)),再加入8 mol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng),靜置10 min,325 nm處測(cè)定A值(Ai);以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚測(cè)得本底A值(Aj);以水代替樣品測(cè)得空白A值(A0),計(jì)算超氧陰離子自由基清除率:

    2.1.2 PSIP清除羥基自由基活性

    參考汪荔等[6]的方法,在10 mL比色管中依次加入不同質(zhì)量濃度的PSIP溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液 2 mL,混勻,靜置 10 min;再加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液2 mL,混勻,37℃保溫30 min,510 nm下測(cè)得不同PSIP濃度A值(Ai);以水代替水楊酸乙醇測(cè)得本底A值(Aj);以水代替樣品測(cè)得空白A值(A0),計(jì)算羥自由基清除率:

    2.2 體內(nèi)試驗(yàn)

    2.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及干預(yù)

    將50只昆明鼠,隨機(jī)分成5組,即對(duì)照組、模型組和PSIP低、中、高劑量組,每組10只,單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,3個(gè)劑量組給予不同濃度的PSIP溶液,模型組和對(duì)照組給予同體積溶劑,連續(xù)灌胃30 d,末次灌胃后,模型組和3個(gè)劑量組禁食16h(過夜),然后一次性灌胃給予50%乙醇12mL/kg BW,6小時(shí)后處死取血,3 500 r/min離心15 min分離血清??焖偃〕龈闻K,生理鹽水沖洗,濾紙吸去多余的生理鹽水,稱重計(jì)算肝指數(shù)(liver index,LI)/%=(肝重/體重)×100,-80℃保存,(對(duì)照組不禁食取材)。

    2.2.2 肝損傷相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

    采用賴氏法測(cè)定血清中ALT、AST活力,磷酸甘油氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法檢測(cè)小鼠肝臟中TG含量,具體操作按照試劑盒說明書方法。

    2.2.3 肝臟組織中氧化/抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

    采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA的量,黃嘌呤氧化酶法測(cè)定T-SOD活力,具體操作按照試劑盒說明書方法。2,4-二硝基苯肼比色法[7]測(cè)定蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PCO)的量。

    Beutler改良法測(cè)定還原性谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)的量,取凍存的肝組織用0.85%生理鹽水制成10%組織勻漿,4 000 r/min離心10 min取上清液。按上清液:20%三氯乙酸為3∶1混合,12 000 r/min離心10 min,收集上清液。取上清液0.1 mL,加入0.3 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液4.4 mL,0.04%二硫雙基苯甲酸溶液0.5 mL,混勻,5 min內(nèi)于412 nm測(cè)定A值,蒸餾水調(diào)零。根據(jù)GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝臟組織中GSH的量。BCA法測(cè)定組織勻漿上清液的蛋白濃度,具體操作按試劑盒說明書方法。

    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    定量資料以±S(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,最小顯著差異法(least significant difference,LSD)進(jìn)行多重比較,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 PSIP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

    PSIP體外對(duì)自由基的清除作用見圖1。

    圖1 PSIP體外對(duì)自由基的清除作用Fig.1 Free radical scavenging activity of PSIP in vitro

    從圖1可知,在1 mg/mL~50 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),PSIP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度的增加而逐漸升高,幾乎呈線性關(guān)系,呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系,其IC50值為34.85 mg/mL。

    3.2 PSIP對(duì)羥基自由基的清除作用

    圖1結(jié)果顯示,PSIP對(duì)·OH有清除作用,且清除率隨著PSIP質(zhì)量濃度(1 mg/mL~50 mg/mL)的增加而不斷增加,表明PSIP的質(zhì)量濃度與·OH清除率呈一定的量效關(guān)系,其IC50值為20.63 mg/mL。

    3.3 PSIP對(duì)小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響

    PSIP對(duì)小鼠LI以及血清中ALT、AST活力和TG水平的影響見表1。

    由表1可知,各試驗(yàn)組小鼠肝指數(shù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,PSIP各劑量組均能顯著降低小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的活力以及TG水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01);并且 PSIP 中高劑量組小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3.4 PSIP對(duì)小鼠MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的水平的影響

    PSIP對(duì)小鼠肝臟組織中MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的影響見表2。

    由表2可知,與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物PCO水平顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);抗氧化物質(zhì)GSH水平和T-SOD活力顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,PSIP各劑量組小鼠肝臟組織中MDA水平顯著降低GSH水平顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01);同時(shí) PSIP 中、高劑量組小鼠肝臟組織中PCO水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),T-SOD活力顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。當(dāng)給予高劑量的 PSIP 灌胃時(shí)(2.60 g/kgBW),能同時(shí)將小鼠肝臟組織中MDA、PCO、GSH、T-SOD恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)。

    表1 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響(±s,n=10)Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT,AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice(±s,n=10)

    表1 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響(±s,n=10)Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT,AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice(±s,n=10)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05 △△P<0.01?!?”表示未給予 PSIP 處理。

    組別劑量/(g/kgBW)LIALT/(U/L)AST/(U/L)TG/(mmol/L)PSIP 0.65 4.01±0.17 37.09±9.56△* 44.06±8.21△** 2.02±0.48△**PSIP 1.30 3.94±0.24 30.11±12.19△△ 38.08±10.47△△ 1.89±0.42△△**PSIP 2.60 4.02±0.36 27.97±10.48△△ 28.09±10.02△△ 1.63±0.16△△**模型 - 4.10±0.20 47.60±9.95** 53.77±11.23** 2.35±0.23**對(duì)照 - 4.16±0.23 27.01±9.52△△ 29.32±7.37△△ 0.87±0.38△△

    表2 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影響(±s,n=10)Table2 Effect of PSIP on levels of MDA,PCO,GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice(±s,n=10)

    表2 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影響(±s,n=10)Table2 Effect of PSIP on levels of MDA,PCO,GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice(±s,n=10)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05 △△P<0.01?!?”表示未給予 PSIP 處理。

    組別劑量/(g/kgBW)MDA/(nmol/mgprot)PCO/(nmol/mgprot)GSH/(μmol/gprot)T-SOD/(U/mgprot)PSIP 0.65 0.81±0.172△** 5.15±0.55* 25.55±3.38△ 210.21±18.36*PSIP 1.30 0.74±0.046△△** 4.36±0.93△△ 27.67±3.01△△ 237.15±22.40△PSIP 2.60 0.69±0.097△△ 3.61±0.93△△ 33.08±5.72△△ 251.41±36.59△△模型 - 0.93±0.161** 5.85±1.00** 20.05±7.19** 207.48±31.93**對(duì)照 - 0.58±0.115△△ 4.04±1.12△△ 29.28±5.28△△ 239.94±16.03△△

    4 結(jié)果與討論

    目前,酒精濫用與酒精中毒已成為全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題,酒精性肝病被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因[8]。在美國(guó)酒精性肝炎患者確診后一個(gè)月內(nèi)死亡率高達(dá)20%~30%[9]。在我國(guó),酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升,已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾病[10]。雖然目前對(duì)酒精性肝病潛在的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[11]。攝入體內(nèi)的酒精90%以上在肝臟中經(jīng)脫氫酶氧化代謝為乙酸鹽,在此過程中會(huì)生成大量的ROS副產(chǎn)物,造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)沉積及過氧化和DNA交聯(lián),且線粒體和細(xì)胞核中的DNA損傷甚至可能阻斷基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,進(jìn)一步導(dǎo)致基因突變或染色體畸變[12]。天然的抗氧化物質(zhì)能夠降低乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的損傷,發(fā)揮保護(hù)作用[13]。

    研究發(fā)現(xiàn),多種植物提取物具有明顯的抗氧化活性如在采用姜黃[14]和柘樹葉[15]提取物干預(yù)后,可顯著提高急性乙醇暴露小鼠肝臟中SOD活力與GSH水平,降低肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。細(xì)胞試驗(yàn)顯示,在1 μmol/L~30 μmol/L范圍內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯能以劑量依賴的方式降低乙醇所致肝細(xì)胞中ROS和MDA的產(chǎn)生[16]。水飛薊油可提高D-半乳糖模型小鼠血清中SOD等抗氧化酶活力,并使其恢復(fù)至正常水平[17]。本研究中體外抗氧化試驗(yàn)顯示,PSIP對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基均有較明顯的清除作用,且在1 mg/mL~50 mg/mL質(zhì)量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在動(dòng)物試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比模型組小鼠血清中ALT活力增高76.2%、AST活力增高83.4%、TG水平增高170.1%,且兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明采用50%乙醇12 mL/kgBW的劑量可明顯誘導(dǎo)小鼠肝臟產(chǎn)生急性損傷和脂質(zhì)沉積。與模型組相比,連續(xù)給予小鼠30 d PSIP后可明顯降低小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平,且PSIP在中劑量時(shí)即可將ALT與AST活力調(diào)至對(duì)照組水平,表明PSIP具有保護(hù)肝臟和調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積作用;同時(shí)給予PSIP后可降低小鼠肝臟中氧化產(chǎn)物MDA和PCO水平提高抗氧化物質(zhì)GSH水平和TSOD活力,而且PSIP在中劑量時(shí)即可將上述指標(biāo)(除MDA)均回調(diào)至對(duì)照組水平。

    以上試驗(yàn)結(jié)果說明,PSIP具有明顯的體外抗氧化活性,并且可通過提高機(jī)體抗氧化水平,減輕肝臟氧化應(yīng)激水平,調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積,從而對(duì)急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

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