伏有為，李彥妮，陳文軍

（安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽合肥230032）

黃精為百合科多年生草本植物黃精（Polygonatum sibricum Red.）、滇黃精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥根莖[1]。黃精始載于晉代《名醫(yī)別錄》，具有滋陰潤(rùn)肺、健脾益腎等作用，同時(shí)也是我國(guó)衛(wèi)計(jì)委公布的藥食同源植物之一?，F(xiàn)代研究顯示，黃精具有抗氧化、降血糖、改善學(xué)習(xí)記憶、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[2]。乙醇進(jìn)入機(jī)體后主要在肝臟內(nèi)氧化代謝并產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），致使機(jī)體氧化還原失衡，誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、炎性細(xì)胞因子釋放和肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致肝臟氧化應(yīng)激損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)，黃精可通過提高小鼠肝臟的抗氧化水平，對(duì)四氯化碳所致化學(xué)性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用[4]，然而黃精對(duì)乙醇所誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷是否有保護(hù)作用目前國(guó)內(nèi)外尚未見明確報(bào)道。鑒于此，本文采用經(jīng)五蒸五曬、打漿、蒸餾、霧化、固化等技術(shù)制得的黃精速溶粉（polygonatum sibricum instant powder，PSIP）作為研究對(duì)象，首先研究其體外抗氧化活性，然后以急性乙醇暴露致肝臟氧化損傷小鼠為模型，進(jìn)一步探究黃精速溶粉的體內(nèi)抗氧化活性和對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用，以期為深度開發(fā)利用黃精奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物及試劑

黃精速溶粉（20170308）：安徽精天有限公司；谷丙轉(zhuǎn) 氨 酶 （alanine aminotransferase，ALT） 試 劑 盒（20171014）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（20171018）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（20171014）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒（20170509）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒（20170518）、BCA 法蛋白定量試劑盒（20170520）：南京建成生物工程研究所；2，4-二硝基苯肼（20130510）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鏈霉素（E22811C251）、鹽酸胍（EZ2811D335）：德國(guó)Biofroxx公司；二硫雙基苯甲酸（Y16M8K30650）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

Synergy H4全功能酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器公司；UV-1200紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；ME104E電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；Bullet Blender組織細(xì)胞破碎儀：美國(guó)Next Advance公司；立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

昆明種雄性 8周齡 SPF 級(jí)小鼠，體重（40±2）g：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011。舒克貝塔牌SPF級(jí)小鼠維持糧（總能量3 616 kcal/kg，三大營(yíng)養(yǎng)素供能比為蛋白質(zhì)20.6%，脂肪12.0%，碳水化合物67.4%）：江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 PSIP體外抗氧化活性研究

2.1.1 PSIP清除超氧陰離子自由基活性

參考文獻(xiàn)[4-5]的方法，在10 mL比色管中加入0.05 mol/L Tric-HCl（pH=8.2）緩沖液4.5 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20 min，依次加入不同質(zhì)量濃度的PSIP溶液2 mL、25 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL，混勻，25℃水浴中反應(yīng)5 min（從加入鄰苯三酚開始計(jì)時(shí)），再加入8 mol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，靜置10 min，325 nm處測(cè)定A值（Ai）；以10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚測(cè)得本底A值（Aj）；以水代替樣品測(cè)得空白A值（A0），計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：

2.1.2 PSIP清除羥基自由基活性

參考汪荔等[6]的方法，在10 mL比色管中依次加入不同質(zhì)量濃度的PSIP溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液 2 mL，混勻，靜置 10 min；再加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液2 mL，混勻，37℃保溫30 min，510 nm下測(cè)得不同PSIP濃度A值（Ai）；以水代替水楊酸乙醇測(cè)得本底A值（Aj）；以水代替樣品測(cè)得空白A值（A0），計(jì)算羥自由基清除率：

2.2 體內(nèi)試驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及干預(yù)

將50只昆明鼠，隨機(jī)分成5組，即對(duì)照組、模型組和PSIP低、中、高劑量組，每組10只，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，3個(gè)劑量組給予不同濃度的PSIP溶液，模型組和對(duì)照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃30 d，末次灌胃后，模型組和3個(gè)劑量組禁食16h（過夜），然后一次性灌胃給予50%乙醇12mL/kg BW，6小時(shí)后處死取血，3 500 r/min離心15 min分離血清?？焖偃〕龈闻K，生理鹽水沖洗，濾紙吸去多余的生理鹽水，稱重計(jì)算肝指數(shù)（liver index，LI）/%=（肝重/體重）×100，-80℃保存，（對(duì)照組不禁食取材）。

2.2.2 肝損傷相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

采用賴氏法測(cè)定血清中ALT、AST活力，磷酸甘油氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法檢測(cè)小鼠肝臟中TG含量，具體操作按照試劑盒說明書方法。

2.2.3 肝臟組織中氧化/抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA的量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定T-SOD活力，具體操作按照試劑盒說明書方法。2，4-二硝基苯肼比色法[7]測(cè)定蛋白質(zhì)羰基（protein carbonyl，PCO）的量。

Beutler改良法測(cè)定還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的量，取凍存的肝組織用0.85%生理鹽水制成10%組織勻漿，4 000 r/min離心10 min取上清液。按上清液：20%三氯乙酸為3∶1混合，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。取上清液0.1 mL，加入0.3 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液4.4 mL，0.04%二硫雙基苯甲酸溶液0.5 mL，混勻，5 min內(nèi)于412 nm測(cè)定A值，蒸餾水調(diào)零。根據(jù)GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝臟組織中GSH的量。BCA法測(cè)定組織勻漿上清液的蛋白濃度，具體操作按試劑盒說明書方法。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

定量資料以±S（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行多重比較，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PSIP對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

PSIP體外對(duì)自由基的清除作用見圖1。

圖1 PSIP體外對(duì)自由基的清除作用Fig.1 Free radical scavenging activity of PSIP in vitro

從圖1可知，在1 mg/mL～50 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PSIP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，幾乎呈線性關(guān)系，呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其IC50值為34.85 mg/mL。

3.2 PSIP對(duì)羥基自由基的清除作用

圖1結(jié)果顯示，PSIP對(duì)·OH有清除作用，且清除率隨著PSIP質(zhì)量濃度（1 mg/mL～50 mg/mL）的增加而不斷增加，表明PSIP的質(zhì)量濃度與·OH清除率呈一定的量效關(guān)系，其IC50值為20.63 mg/mL。

3.3 PSIP對(duì)小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響

PSIP對(duì)小鼠LI以及血清中ALT、AST活力和TG水平的影響見表1。

由表1可知，各試驗(yàn)組小鼠肝指數(shù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，PSIP各劑量組均能顯著降低小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的活力以及TG水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；并且 PSIP 中高劑量組小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.4 PSIP對(duì)小鼠MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的水平的影響

PSIP對(duì)小鼠肝臟組織中MDA、PCO、GSH水平及T-SOD活力的影響見表2。

由表2可知，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝臟中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物PCO水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；抗氧化物質(zhì)GSH水平和T-SOD活力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，PSIP各劑量組小鼠肝臟組織中MDA水平顯著降低GSH水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；同時(shí) PSIP 中、高劑量組小鼠肝臟組織中PCO水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），T-SOD活力顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）。當(dāng)給予高劑量的 PSIP 灌胃時(shí)（2.60 g/kgBW），能同時(shí)將小鼠肝臟組織中MDA、PCO、GSH、T-SOD恢復(fù)至對(duì)照組水平（P＞0.05）。

表1 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響（±s，n=10）Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT，AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

表1 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠LI、ALT和AST活力及TG水平的影響（±s，n=10）Table1 Effect of PSIP on LI and activities of ALT，AST and levels of TG in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05 △△P＜0.01?！?”表示未給予 PSIP 處理。

組別劑量/（g/kgBW）LIALT/（U/L）AST/（U/L）TG/（mmol/L）PSIP 0.65 4.01±0.17 37.09±9.56△* 44.06±8.21△** 2.02±0.48△**PSIP 1.30 3.94±0.24 30.11±12.19△△ 38.08±10.47△△ 1.89±0.42△△**PSIP 2.60 4.02±0.36 27.97±10.48△△ 28.09±10.02△△ 1.63±0.16△△**模型 - 4.10±0.20 47.60±9.95** 53.77±11.23** 2.35±0.23**對(duì)照 - 4.16±0.23 27.01±9.52△△ 29.32±7.37△△ 0.87±0.38△△

表2 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影響（±s，n=10）Table2 Effect of PSIP on levels of MDA，PCO，GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

表2 PSIP對(duì)乙醇氧化損傷小鼠MDA、PCO、GSH水平和T-SOD活力的影響（±s，n=10）Table2 Effect of PSIP on levels of MDA，PCO，GSH and activities of T-SOD in ethanol-induced oxidative damaged mice（±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05 △△P＜0.01?！?”表示未給予 PSIP 處理。

組別劑量/（g/kgBW）MDA/（nmol/mgprot）PCO/（nmol/mgprot）GSH/（μmol/gprot）T-SOD/（U/mgprot）PSIP 0.65 0.81±0.172△** 5.15±0.55* 25.55±3.38△ 210.21±18.36*PSIP 1.30 0.74±0.046△△** 4.36±0.93△△ 27.67±3.01△△ 237.15±22.40△PSIP 2.60 0.69±0.097△△ 3.61±0.93△△ 33.08±5.72△△ 251.41±36.59△△模型 - 0.93±0.161** 5.85±1.00** 20.05±7.19** 207.48±31.93**對(duì)照 - 0.58±0.115△△ 4.04±1.12△△ 29.28±5.28△△ 239.94±16.03△△

4 結(jié)果與討論

目前，酒精濫用與酒精中毒已成為全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，酒精性肝病被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因[8]。在美國(guó)酒精性肝炎患者確診后一個(gè)月內(nèi)死亡率高達(dá)20%～30%[9]。在我國(guó)，酒精性肝病的發(fā)病率逐年上升，已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝臟疾病[10]。雖然目前對(duì)酒精性肝病潛在的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在酒精性肝病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[11]。攝入體內(nèi)的酒精90%以上在肝臟中經(jīng)脫氫酶氧化代謝為乙酸鹽，在此過程中會(huì)生成大量的ROS副產(chǎn)物，造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)沉積及過氧化和DNA交聯(lián)，且線粒體和細(xì)胞核中的DNA損傷甚至可能阻斷基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步導(dǎo)致基因突變或染色體畸變[12]。天然的抗氧化物質(zhì)能夠降低乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的損傷，發(fā)揮保護(hù)作用[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，多種植物提取物具有明顯的抗氧化活性如在采用姜黃[14]和柘樹葉[15]提取物干預(yù)后，可顯著提高急性乙醇暴露小鼠肝臟中SOD活力與GSH水平，降低肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。細(xì)胞試驗(yàn)顯示，在1 μmol/L～30 μmol/L范圍內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯能以劑量依賴的方式降低乙醇所致肝細(xì)胞中ROS和MDA的產(chǎn)生[16]。水飛薊油可提高D-半乳糖模型小鼠血清中SOD等抗氧化酶活力，并使其恢復(fù)至正常水平[17]。本研究中體外抗氧化試驗(yàn)顯示，PSIP對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基均有較明顯的清除作用，且在1 mg/mL～50 mg/mL質(zhì)量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。在動(dòng)物試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比模型組小鼠血清中ALT活力增高76.2%、AST活力增高83.4%、TG水平增高170.1%，且兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明采用50%乙醇12 mL/kgBW的劑量可明顯誘導(dǎo)小鼠肝臟產(chǎn)生急性損傷和脂質(zhì)沉積。與模型組相比，連續(xù)給予小鼠30 d PSIP后可明顯降低小鼠血清中ALT、AST活力和TG水平，且PSIP在中劑量時(shí)即可將ALT與AST活力調(diào)至對(duì)照組水平，表明PSIP具有保護(hù)肝臟和調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積作用；同時(shí)給予PSIP后可降低小鼠肝臟中氧化產(chǎn)物MDA和PCO水平提高抗氧化物質(zhì)GSH水平和TSOD活力，而且PSIP在中劑量時(shí)即可將上述指標(biāo)（除MDA）均回調(diào)至對(duì)照組水平。

以上試驗(yàn)結(jié)果說明，PSIP具有明顯的體外抗氧化活性，并且可通過提高機(jī)體抗氧化水平，減輕肝臟氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)沉積，從而對(duì)急性乙醇暴露導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷發(fā)揮保護(hù)作用。