李曉輝，倪賽巧，王 翀，王彥波，張 巖，傅玲琳,

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018；2.河北省食品檢測研究院，河北 石家莊 050091）

魚類過敏主要是由免疫球蛋白E（immunoglobulins E，IgE）介導的即時型過敏，主要癥狀為嘔吐、腹瀉等，嚴重時會引發(fā)過敏性休克，危及生命[1]。早在2001年，I型膠原蛋白（collagen，CO）已被證實有較強的過敏原性[2]，是僅次于小清蛋白的魚類過敏原，而且有研究表明日本50%左右的魚過敏患者對I型膠原蛋白過敏[3]。I型膠原蛋白由2 條α1亞基和1 條α2亞基組成，呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為300 kDa[4]。I型膠原蛋白具有良好的生物相容性、易于生物降解、無毒性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學材料等領(lǐng)域[5]。目前對魚I型膠原蛋白的研究主要集中在提取與純化以及其理化性質(zhì)方面[6]，但鮮見魚I型膠原蛋白作為食物過敏原的研究。因此，魚I型膠原蛋白的安全性問題更需要引起人們的重視。

超高壓是一種非熱力加工技術(shù)，通過破壞蛋白質(zhì)的非共價鍵，改變蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)，導致蛋白質(zhì)變性，研究證實可以降低過敏原的致敏性[7]。而蛋白酶通過水解致敏蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，破壞構(gòu)象表位，或者斷裂酰胺鍵，破壞線性表位，減弱其免疫原性。Long Fangyu等[8]證實55 ℃時，500 MPa超高壓維持10 min可降低南美白對蝦原肌球蛋白（tropomyosin，TM）73.59%的致敏性。Yu Huilin等[9]分別采用煮沸、超聲波煮沸結(jié)合、高壓蒸煮處理擬穴青蟹中的TM，并對3 種方法進行比較分析，發(fā)現(xiàn)高壓蒸煮是加快胃腸消化、減弱IgG/IgE結(jié)合力最有效的方式。韓建勛[10]對原肌球蛋白進行超高壓處理，研究表明超高壓處理導致TM致敏性發(fā)生波動性變化，200～300 MPa致敏性下降，400～500 MPa致敏性上升，600 MPa時致敏性又略微下降。Kato等[11]研究表明加壓增強滲透性，使得部分蛋白溶解到周圍溶液中，從而減少大米中的過敏蛋白含量。Shimakura等[12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶P酶解處理后，甲殼類的蛋白抽提物的免疫原性幾乎完全喪失。經(jīng)堿性蛋白酶水解后，大豆過敏原P34的過敏原性基本為0[13]。但是迄今為止，鮮見魚I中型膠原蛋白抗原性消減的相關(guān)研究。鑒于此，本實驗以虹鱒魚過敏原I型膠原蛋白為研究對象，探討了超高壓和酶解技術(shù)對其抗原性的影響，為魚類產(chǎn)品中膠原蛋白的過敏原消減提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss） 寧波今日食品有限公司。

Anti-Collagen I抗體（兔抗魚I型膠原蛋白抗體）英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標羊抗兔IgG抗體 杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；TMB顯色液美國eBioscience公司；胰蛋白酶、α-糜蛋白酶 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPB.A2-600/0.6超高壓處理設(shè)備 天津市華泰森森生物工程技術(shù)有限公司；Versamax酶標儀美國Molecular Devices公司；全套電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Alpha化學發(fā)光凝膠成像儀 美國Protein Simple公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的提取與純化

膠原蛋白的提取與純化根據(jù)Liu Dasong[14]和Duan Rui[15]等的方法，并略作修改，操作均在4 ℃進行。首先將虹鱒魚皮用剪刀剪成0.5 cm×0.5 cm的碎魚皮，加入20 倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液，攪拌，浸提36 h，每6 h換液1 次，去除雜蛋白和色素。過濾后用雙蒸水反復清洗，直至洗出液為中性。瀝干后加入20 倍體積的10%正丁醇溶液，攪拌，浸提24 h，每6 h換液一次，去除魚皮中的脂肪。此后用雙蒸水反復清洗碎魚皮，瀝干后加入30 倍體積的0.5 mol/L醋酸溶液，攪拌，浸提72 h，8 000×g離心15 min，取上清液。加入預先研磨好的NaCl粉末進行鹽析，攪拌，直至最終鹽濃度為0.8 mol/L，8 000×g離心15 min，取沉淀。沉淀復溶于0.5 mol/L醋酸，分別在外液為0.1 mol/L醋酸溶液和雙蒸水中透析48 h，凍干得到虹鱒魚I型膠原蛋白，保存于－80 ℃冰箱備用。

1.3.2 超高壓處理

采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將膠原蛋白溶解并稀釋至1 mg/mL，真空包裝密封（無氣泡），在25 ℃下超高壓處理10 min，壓力分別設(shè)置為100、200、300、400、500 MPa，陽性對照組為未進行超高壓處理（0.1 MPa）的I型膠原蛋白。

1.3.3 酶處理

分別采用α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對1 mg/mL同批次I型膠原蛋白酶解處理20 min[16]。酶解溫度為酶最適溫度，pH值為酶相應(yīng)最適pH值[17-19]，酶與底物質(zhì)量比（enzyme∶substrate，E∶S）分別為1∶100 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶100、1∶10，酶解結(jié)束沸水浴5 min滅酶[12]，滅酶后立即將樣品置于冰上。陽性對照組為未進行酶處理的I型膠原蛋白。

表1 酶最適溫度及pH值Table1 Optimal temperature and pH of proteases

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）對提取的I型膠原蛋白進行鑒定以及對處理前后蛋白分子質(zhì)量變化進行檢測[20]。分離膠為10%，濃縮膠為5%，樣品的蛋白質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，上樣量均為10 μL，初始電壓為80 V，溴酚藍指示劑到達分離膠與濃縮膠交界處改變電壓為120 V。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍R-250染色40 min，再用脫色液脫色直至蛋白條帶清晰，用凝膠成像儀進行拍照，最后用AlphaView SA 3.4.0電泳圖像處理軟件進行分析。

1.3.5 抗原性分析

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法對超高壓及酶解處理前后膠原蛋白的抗原性進行檢測。用包被緩沖液將處理前后的I型膠原蛋白稀釋至5 μg/mL，酶標板每孔加入100 μL，4 ℃包被過夜。去除包被液后每孔加入200 μL PBST（PBS＋吐溫20），清洗5 次，每次1 min，去除洗滌液后拍干。每孔加入200 μL封閉液（PBS＋3% BSA），37 ℃下封閉2 h。去除封閉液，用洗滌液清洗5 次，拍干。每孔加入100 μL Anti-Collagen I抗體（稀釋倍數(shù)4 000），37 ℃下孵育1.5 h。去除酶標板中的液體，用PBST清洗5 次，拍干。每孔加入100 μL HRP標羊抗兔IgG抗體（稀釋倍數(shù)6 000），37 ℃下孵育1.5 h。去除酶標板中的液體，用PBST清洗5 次，拍干。每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃下避光孵育20 min。每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定每孔在450 nm波長處的OD值[21]。未經(jīng)任何處理的I型膠原蛋白為陽性對照，BSA為陰性對照。以O(shè)D450nm表示各組蛋白抗原性，兩者呈正相關(guān)，并根據(jù)下式計算消減率[22]。

式中：OD陽為未經(jīng)任何處理的I型膠原蛋白的OD值；OD樣為處理后的I型膠原蛋白樣品的OD值；OD陰為BSA的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3 次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 I型膠原蛋白的提取與純化

如圖1所示，在電泳條件下，虹鱒魚膠原蛋白穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，亞基發(fā)生解離。經(jīng)0.5 mol/L醋酸提取以及鹽析純化得到的虹鱒魚膠原蛋白由α1（約119.5 kDa）、α2（約107.5 kDa）、β（由α1和α2亞基組成，約200 kDa）以及少量γ亞基組成。經(jīng)AlphaView SA 3.4.0電泳圖像軟件分析，提取的膠原蛋白純度為85%，符合后續(xù)實驗要求。這些結(jié)果與文獻[23-25]報道的其他魚I型膠原蛋白一致。

圖1 I型膠原蛋白SDS-PAGE分析Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis of type I collagen

如圖2所示，BSA是陰性對照，提取的膠原蛋白的OD450nm是陰性對照組的2.1 倍，所提蛋白能與魚Anti-Collagen I抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，證實純化得到的蛋白為I型膠原蛋白。

2.2 超高壓對虹鱒魚I型膠原蛋白分子質(zhì)量的影響

圖3 超高壓對I型膠原蛋白分子質(zhì)量的影響Fig .3 Effect of HHP on molecular mass of type I collagen

圖3 （超高壓處理的蛋白）與圖1（未處理的蛋白）進行比較，經(jīng)超高壓（100～500 MPa）處理后，虹鱒魚I型膠原蛋白的α1、α2、β、γ亞基均未發(fā)生降解，表明壓力的升高對I型膠原蛋白的分子質(zhì)量沒有影響。

2.3 酶解對虹鱒魚I型膠原蛋白分子質(zhì)量的影響

圖4 酶解對I型膠原蛋白分子質(zhì)量的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis on molecular mass of type I collagen

如圖4所示，α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶均能水解I型膠原蛋白。隨著E∶S逐漸增大，α1、α2、β、γ亞基逐漸降解，直至電泳圖中已無法觀察到任何條帶，表明I型膠原蛋白已充分水解成小分子質(zhì)量蛋白或多肽。上述這3 種蛋白酶水解度都比較大，相比而言，胰蛋白酶的水解能力更強。SDS-PAGE只能反映蛋白質(zhì)降解情況，無法反映蛋白質(zhì)的抗原性，因此還需進行后續(xù)ELISA分析[26]。

2.4 超高壓對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響

如圖5、6所示，陽性對照組與超高壓處理組進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超高壓處理后，I型膠原蛋白的抗原性均明顯下降。超高壓處理組間進行比較，隨著壓力逐漸升高至200 MPa時，I型膠原蛋白的抗原性呈下降趨勢。25 ℃，200 MPa下，超高壓處理10 min時，抗原性降至最低，抗原性消減了42.66%，可能是因為隨著壓力上升，I型膠原蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變，其構(gòu)象表位被破壞，抗原性隨之下降。而壓力從200 MPa升至500 MPa時，抗原性又有所上升，但仍然低于陽性對照組，可能是因為結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，包埋于內(nèi)部的線性表位暴露出來，抗原性也因此升高[27]。綜上所述，超高壓處理能有效降低虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性。

圖5 壓力對I型膠原蛋白抗原性的影響Fig. 5 Effect of pressure on antigenicity of type I collagen

圖6 壓力對I型膠原蛋白抗原性消減率的影響Fig. 6 Effect of pressure on reduction rate of antigenicity of type I collagen

2.5 酶解對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響

2.5.1 α-糜蛋白酶水解對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響

圖7 α-糜蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性的影響Fig. 7 Effect of chymotrysin/substrate ratio on antigenicity of type I collagen

如圖7、8所示，陽性對照組與α-糜蛋白酶酶解處理組進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過α-糜蛋白酶水解后，I型膠原蛋白的抗原性均明顯下降。而且隨著E∶S增大，I型膠原蛋白的抗原性呈下降趨勢，當37 ℃、pH 7.8、E∶S為1∶10，α-糜蛋白酶水解20 min時，I型膠原蛋白的抗原性最弱，抗原性減弱了78.21%。因此，α-糜蛋白酶水解能有效降低虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性。

圖8 α-糜蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性消減率的影響Fig. 8 Effect of chymotrypsin/substrate ratio on reduction rate of antigenicity of type I collagen

2.5.2 木瓜蛋白酶水解對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響

圖9 木瓜蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性的影響Fig .9 Effect of papain/substrate ratio on antigenicity of type I collagen

圖10 木瓜蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性消減率的影響Fig .10 Effect of papain/substrate ratio on reduction rate of antigenicity of type I collagen

如圖9、10所示，陽性對照組與木瓜蛋白酶酶解處理組進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后，I型膠原蛋白的抗原性均得到有效消減。而且E∶S越大，I型膠原蛋白的抗原性越弱，當37 ℃、pH 7.8、E∶S為1∶10，木瓜蛋白酶水解20 min時，I型膠原蛋白的抗原性最弱，抗原性降低了78.21%。綜上所述，與α-糜蛋白酶比較，木瓜蛋白酶水解能更有效降低虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性。

2.5.3 胰蛋白酶水解對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響

圖11 胰蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性的影響Fig. 11 Effect of trypsin/substrate ratio on antigenicity of type I collagen

圖12 胰蛋白酶與底物比對I型膠原蛋白抗原性消減率的影響Fig .12 Effect of trypsin/substrate ratio on reduction rate of antigenicity of type I collagen

如圖11、12所示，陽性對照組與胰蛋白酶酶解處理組進行比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過胰蛋白酶水解后，I型膠原蛋白的抗原性急劇下降。當E∶S從1∶100 000增加至1∶1 000，I型膠原蛋白的抗原性快速下降，當E∶S從1∶1 000增加至1∶10時，魚I型膠原蛋白抗原性下降緩慢。因此，溫度45 ℃、pH 8.0、酶解時間20 min、E∶S為1∶10，是胰蛋白酶水解消減I型膠原蛋白抗原性的最佳酶解條件。E∶S為1∶10的酶解組與陰性對照組進行比較，沒有顯著差異（P＞0.05），表明經(jīng)E∶S為1∶10的胰蛋白酶水解后，虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性幾乎完全喪失。與上述兩種蛋白酶進行比較，胰蛋白酶是降低虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的最佳蛋白酶。

3 討 論

有研究表明不僅I型膠原蛋白有較強的致敏性，變性膠原蛋白（明膠）也存在過敏原免疫活性[28]。即使140 ℃加熱10 min或100 ℃加熱320 min，I型膠原蛋白發(fā)生降解，但其過敏原性仍未改變[29]，表明熱處理無法消減魚I型膠原蛋白的過敏原活性。相比于其他食物過敏原消減技術(shù)，超高壓及酶解操作較為簡便，而且這兩種技術(shù)已成功降低了多種過敏原的致敏性。因此，本實驗采用這兩種技術(shù)探討其對I型膠原蛋白抗原性的影響。

間接ELISA結(jié)果表明I型膠原蛋白的抗原性隨著壓力的升高呈“U”形趨勢，而在最佳超高壓條件即200 MPa時，I型膠原蛋白的抗原性能減弱42.66%。另外，經(jīng)α-糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解后，I型膠原蛋白的抗原性均明顯下降，而且隨著E∶S的增加呈下降趨勢。酶處理后I型膠原蛋白發(fā)生水解，這是酶解降低虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性的機制之一。是否存在其他機制，還有待于進一步的研究。胰蛋白酶對I型膠原蛋白的抗原效果最佳，木瓜蛋白酶次之，α-糜蛋白酶最弱，尤其當酶為胰蛋白酶，45 ℃、pH 8.0、E∶S為1∶10、水解20 min時，虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性幾乎完全喪失，抗原性能減弱97.69%。上述結(jié)果可能是胰蛋白酶的水解能力比α-糜蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解能力強導致的。超高壓處理與酶解處理的I型膠原蛋白是同一批次提取的I型膠原蛋白，因此，超高壓及酶解這兩種方法對虹鱒魚I型膠原蛋白抗原性的影響具有可比性。與超高壓處理比較，酶解是消減虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性更為有效的方式。造成該結(jié)果的原因可能是超高壓只能通過改變空間結(jié)構(gòu)破壞構(gòu)象表位，而酶解處理既可以破壞構(gòu)象表位又可以破壞過敏原的線性表位。綜上所述，45 ℃、pH 8.0、E∶S為1∶10，胰蛋白酶酶解20 min是消減虹鱒魚I型膠原蛋白的抗原性的最佳方式。

雖然超高壓處理最高只能降低I型膠原蛋白42.66%的抗原性，而酶解能使I型膠原蛋白的抗原性幾乎完全喪失。但是超高壓作為非熱加工技術(shù)，用于食物保存，能夠延長保質(zhì)期，對食品本身的口味及營養(yǎng)影響較小，而在酶解過程中，可能會產(chǎn)生苦味肽等物質(zhì)，影響口味[30]。而且蛋白酶不只水解過敏蛋白，還會水解食物中的其他蛋白，可能會造成營養(yǎng)損失。因此，在以后的研究中需進行品質(zhì)研究及感官評價，并建立一個既能降低過敏原性又不影響營養(yǎng)、感官等品質(zhì)的方法。