楊瑞 ，陳良健 ，劉裕玲 ，張建軍 ，顏彩霞 ，李旭進(jìn) ，羅宇山 ，陳偉

（1.國(guó)藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225127；2.廣東省臺(tái)山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東 臺(tái)山 529200；3.廣東省云浮市新興縣簕竹鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)站，廣東 云浮 527400）

禽傳染性支氣管炎 （avian infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV）引起的雞的一種急性、傳播迅速的病毒性疾病。IBV可導(dǎo)致肉雞的增重和飼料報(bào)酬降低；肉雞呼吸道損傷后，還會(huì)引起繼發(fā)性的細(xì)菌感染，導(dǎo)致高達(dá)30%以上的死亡率；有些毒株可以引起嚴(yán)重的腎病病變[1，2，3]。也有研究報(bào)道，某些IBV毒株可引起輸卵管病變，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降，畸形蛋數(shù)量增多，蛋殼顏色發(fā)生改變等；而雛雞感染IBV后還會(huì)導(dǎo)致輸卵管不能正常發(fā)育造成“假母雞”。S1蛋白與IBV感染性、致病性密切相關(guān)，含有與病毒中和、細(xì)胞吸附、組織嗜性、血清型有關(guān)的抗原位點(diǎn)，也是最容易發(fā)生遺傳變異的結(jié)構(gòu)蛋白；因此S1基因序列被常用于IBV的 基因分 型[2，3，4]。

2017年12月份，廣東省臺(tái)山市某養(yǎng)殖場(chǎng)所飼養(yǎng)的黃羽肉雞發(fā)生了一種以呼吸困難、潛伏期短、發(fā)病速度快為主要特征的疫病；以支氣管有粘液或干酪樣物為主要剖檢病變。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)等進(jìn)行綜合分析，將此次疫病確診為QX型IBV感染所致；現(xiàn)將其進(jìn)行闡述以期廣大養(yǎng)殖企業(yè)加強(qiáng)該病的診斷和防治。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集 對(duì)患病雞進(jìn)行剖檢，觀察病變狀況；無(wú)菌采集病變較明顯的氣管、肺臟、腎臟等組織。

1.3 細(xì)菌分離 無(wú)菌采集肝臟，接種麥康凱瓊脂平板和血平板進(jìn)行細(xì)菌分離，37℃培養(yǎng)24h左右，觀察結(jié)果。

1.4 病毒分離 將采集的臟器組織用滅菌PBS（pH7.2）按1:5進(jìn)行充分研磨，反復(fù)凍融三次后，接種10日齡SPF雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)5d，收獲尿囊液并觀察雞胚胚體病變。

1.5 PCR檢測(cè) 將收獲的尿囊液，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)IBV。參考文章[5]中發(fā)表的S1序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：

上游引物序列為：

5'-TTGAAAACTGAACAAAAGACCG-3'，

下游引物序列為：

5'-TACAAAACCTGCCATAACTAACAT-3'。

預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段約為1600bp。

1.6 S1基因序列的序列測(cè)定及分析 將擴(kuò)增的目的片段，送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。利用MEGA4.1軟件對(duì)所測(cè)S1基因序列進(jìn)行分析，并與世界各地已報(bào)道的部分分離毒株進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變 對(duì)送檢病雞進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，腎臟腫大，支氣管內(nèi)有栓塞，其它臟器眼觀無(wú)異常，腎臟、支氣管的病理變化見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 腎臟腫大

圖2 支氣管栓塞

2.2 細(xì)菌分離 置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后，麥康凱瓊脂平板和血平板培養(yǎng)基上均未觀察到任何細(xì)菌生長(zhǎng)，故可以排除細(xì)菌感染。

2.3 病毒分離 將采集的氣管、肺臟、脾臟等組織充分研磨后接種10日齡SPF雞胚，連續(xù)培養(yǎng)5d后，雞胚胚體呈侏儒狀，呈IBV感染典型病變，如圖3所示。

圖3 雞胚病變

2.4 PCR檢測(cè)及序列分析 電泳結(jié)果顯示，以收獲雞胚尿囊液所提取的RNA為模板，通過(guò)RTPCR可擴(kuò)增出與目的片段大小相符的特異性條帶，如圖4所示。

圖4 S1基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用生物信息學(xué)軟件MEGA 4.1分析所測(cè)S1基因序列，并與世界各地已報(bào)道的部分分離毒株進(jìn)行序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該分離株與QX型IBV的同源性高達(dá)96%以上，可以確定引起此次疫病的病原為QX型IBV。S1基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹見(jiàn)圖5。

圖4 S1基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

IBV最早在1930年于美國(guó)的北達(dá)科他州被發(fā)現(xiàn)；鄺榮祿于1972年在我國(guó)廣東省首次出報(bào)道；目前，已然成為危害家禽養(yǎng)殖的重要疫病之一。IBV可在哈德氏腺、呼吸道、腸道、腎臟、輸卵管以及公雞的睪丸等多種組織器官中復(fù)制。一般來(lái)說(shuō)不論IBV分離株來(lái)自何種組織，它們都易感染雞的呼吸道并在氣管產(chǎn)生特征性病變，一些野毒株還會(huì)引起嚴(yán)重的呼吸道癥狀。根據(jù)臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)毒株既能引起呼吸道癥狀也能引起腎臟的病變，而且隨著外界環(huán)境條件、感染年齡等差異表現(xiàn)出的致病特點(diǎn)也存在差異[2，5]。

由于RNA病毒的復(fù)制過(guò)程中缺乏錯(cuò)誤修復(fù)機(jī)制，因此對(duì)于IBV而言，遺傳變異是一個(gè)非常普遍的現(xiàn)象，基因組的點(diǎn)突變、堿基插入或缺失以及不同毒株間的基因重組均可造成的變異。據(jù)報(bào)道，在我國(guó)當(dāng)前流行的毒株基因型數(shù)量超過(guò)10個(gè)，包括 QX 型、CK/CH/LSC/99I型、LDT3/03 型、793/B型和 TW-I型、TW-II型、HN03 型、CH III型、CH VI型等；其中QX型己經(jīng)成為當(dāng)前在我國(guó)流行的最主要的優(yōu)勢(shì)基因型，毒株數(shù)量己經(jīng)占到分離總數(shù)的 50%以上，且還在呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2，3，4]。我國(guó)目前所使用的疫苗主要是LDT3型和以H120、H52、W93、28/86、Ma5 等為代表的 Mass 型疫苗；大量的研究結(jié)果表明，現(xiàn)有疫苗已經(jīng)不能對(duì)當(dāng)前流行的部分基因型毒株產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻。據(jù)了解，揚(yáng)州大學(xué)吳艷濤教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)大量的流行病學(xué)分析及疫苗株篩選等工作，研發(fā)了與當(dāng)前IBV流行趨勢(shì)相匹配的疫苗，目前已經(jīng)進(jìn)入新獸藥申請(qǐng)階段，此疫苗的推出可能對(duì)當(dāng)前主要流行的QX型IBV防控發(fā)揮重要作用。

針對(duì)IBV的防控，建議做好以下幾點(diǎn)：①制訂嚴(yán)格的生物安全措施并認(rèn)真執(zhí)行。養(yǎng)殖小區(qū)實(shí)行全進(jìn)全出制、嚴(yán)格檢疫、隔離、消毒等措施，防止IBV的侵入及擴(kuò)散；②制訂科學(xué)合理的免疫程序。目前，在與流行的優(yōu)勢(shì)基因型匹配的QX型疫苗尚無(wú)法獲得的情況下，可通過(guò)將現(xiàn)有疫苗組合進(jìn)行聯(lián)合免疫從而增加廣譜的交叉免疫保護(hù)效果。對(duì)于生長(zhǎng)期較長(zhǎng)的黃羽肉雞，一般需要進(jìn)行3次左右的活疫苗免疫；20日齡左右增加一次滅活疫苗；③加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。定期對(duì)所飼養(yǎng)的雞群進(jìn)行免疫檢測(cè)，及時(shí)了解雞群的健康狀況，盡量避免發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染。大量的臨床數(shù)據(jù)表明，當(dāng)雞群發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染時(shí)發(fā)病率和死亡率均有大幅的增加；目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)IBV與大腸桿菌、支原體和H9亞型低致病性禽流感病毒之間存在明顯 的 協(xié)同 致 病作 用[4，5，7]。