周凌云，周 琳，劉紅艷，李 維，向 芬，曾澤萱

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

中國是茶葉的原產(chǎn)地，有著豐富的茶樹資源，茶樹品種約占全球品種總數(shù)的4/5，但目前報道的茶樹病害不及全世界報道病害總數(shù)的1/3，茶樹病害還存在很多未被識別的種類。茶葉一旦被病原真菌侵染發(fā)病，不僅會影響茶樹的光合作用，還會使茶葉品質(zhì)下降，而病害防控的首要前提必須明確其病原菌。一般茶樹病害在田間表現(xiàn)癥狀有差異，在室內(nèi)不同培養(yǎng)基上展現(xiàn)形態(tài)有變化。筆者在茶園中發(fā)現(xiàn)有一種從葉緣開始褐變的病斑，形狀沒有規(guī)則，不管是嫩葉還是成葉上，表面均未發(fā)現(xiàn)有黑色子實體，在田間與茶輪斑病、茶炭疽病等常見病害的典型表型不完全一致。本試驗從長沙茶區(qū)采集病害樣本，進行褐斑病病原菌的分離，基于其形態(tài)學特性和 rDNA-ITS 序列分析進行鑒定，并采用柯赫氏法則進行病害鑒定與致病性分析，以期為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及癥狀觀察

2017年8～12月，于湖南省茶葉研究所試驗基地發(fā)現(xiàn)茶樹葉斑病，采集具有典型癥狀的2批次病葉，選取具有典型癥狀的病葉標本，在體視顯微鏡下觀察并記錄病害癥狀。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)、致病性測定

1.2.1 病原菌分離、純化與培養(yǎng)

采用組織分離法[1]對茶葉斑病樣品進行病原菌分離，接種于PDA 培養(yǎng)基、于25℃恒溫培養(yǎng)。將生長的菌落進行單孢分離純化培養(yǎng)后，以進行形態(tài)觀察與回接致病的實驗備用。

1.2.2 病原菌致病性測定

采用菌絲塊傷口接種法進行致病性測定。將培養(yǎng)7 d的菌落用打孔器挑選直徑為5 mm的菌絲塊備用。取健康無病茶葉，接種菌株于茶葉右邊，左邊接種空白PDA 培養(yǎng)基為對照，28℃下保濕培養(yǎng)，逐日觀察葉片的發(fā)病情況。

1.3 病原菌形態(tài)學與分子鑒定

接種純化單孢菌株于直徑為90 mm的PDA平板上，置于28℃恒溫下暗培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)，記錄菌絲特征。14 d后顯微觀察分生孢子，觀察它們的形態(tài)并測量其大小。

將供試菌株接種于 PDA 培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)6 d，收集菌絲，采用SK8255 Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取病菌總DNA。采用通用引物ITS1/ITS4[2]，ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 與 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行 PCR擴增。

PCR 反應條件：94℃預變性10 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，25個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃∞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，應用SK8131膠回收試劑盒回收，送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的序列于GenBank核酸序列庫進行同源性比對分析，并用 Mega 6.0的Neighbor-joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

褐斑病發(fā)生初期，多從葉緣或葉尖開始出現(xiàn)小斑點，主要發(fā)生在成葉上，病斑不整形，灰色或灰褐色，有一褐色邊緣（圖1-A）。隨著病害的發(fā)展，病斑中間變成灰白色，易干枯破裂，稍凹陷，淺灰褐色至深褐色，表面未見子實體（圖1-B）。

圖1-A 嫩葉褐葉斑病癥Fig 1-A Tea brown spot disease on tender tealeaf

圖1-B 老葉褐葉斑病癥Fig 1-B Tea brown spot disease on older tealeaf

2.2 致病性

采用菌絲塊接種的方法接種茶葉，接種初期病斑為灰色或灰褐色，有一褐色邊緣，茶病斑不整形。接種3 d 菌塊邊緣表現(xiàn)為水漬狀、圓形病斑、有黃色暈圈（圖 2-A）；6 d后黃色暈圈明顯，病斑呈不規(guī)則橢圓形，中心為褐色（圖2-B）。且從病斑上均能再次分離純化出同一種接種菌。

圖2-A 病菌回接茶樹葉片2 d的形態(tài)特征Fig.2-A Morphological characteristics of tea leaves after two days inoculation with pathogenic fungi

圖2-B 病菌回接茶樹葉片7 d的形態(tài)特征Fig. 2-B Morphological characteristics of tea leaves after seven days inoculation with pathogenic fungi

2.3 病原菌的形態(tài)特征

分離菌株在 PDA 培養(yǎng)基上不能產(chǎn)孢，菌落正面灰褐色，菌落背面可見褐色輪圈，并呈現(xiàn)扇形墨綠色（圖 3-A）。病菌接種茶葉后，接種部位逐漸變褐。通過切片觀察，子囊孢子磚格狀、具有7個分格，黃褐色，中央部有收縊，大小（28～32）μm×（12～17）μm（圖 3-B）。該病菌的形態(tài)特征與病原菌為Pleospora camelliaeDippen形態(tài)特征相似[3-4]。

圖3-A 菌落形態(tài)Fig 3-A Colony morphology

圖3-B 分生孢子形態(tài)Fig. 3-B Conidia morphology

2.4 病原菌的 rDNA-ITS 序列分析

引物ITS1/ITS4從菌株MK4501221基因組中擴增出長度為566 bp的DNA片段（圖 4-A）。利用Blast進行同源性比較比對，結果顯示病原菌的ITS基因序列與已報道Pleospora sp（寄主茶葉、羅漢果）同源性在99%以上（圖 4-B）。構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，菌株與Pleospora sp聚在同一個分支上。結合形態(tài)學特征及分子生物學鑒定結果，最終確認此病原菌（Z02）為茶格孢腔菌。

圖4-A 病菌PCR電泳Fig.4-A Germicide PCR

圖4-B 基于病菌Z02核苷酸序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.4-B Phylogenetic tree constructed based on nucleotide sequence of pathogen Z02

3 結論與討論

葉斑病是茶樹的重要病害，引起葉斑病的病原菌分別為茶炭疽病、茶輪斑病及茶云紋葉斑病等[5-7]，而且它們的形態(tài)學特征非常相似，難于區(qū)分，必須依賴于分子鑒定技術。

格孢腔菌屬子囊菌亞門、腔菌綱、座囊菌目、格孢腔菌科、格孢腔菌屬（Pleospora）。目前茶葉病害中除了蘇聯(lián)、波多黎各、南非諸國報道格孢腔病菌Pleospora camelliae Dippen的發(fā)生[8]，我國僅在江蘇、福建發(fā)現(xiàn)了一種茶樹可培養(yǎng)內(nèi)生菌Pleospora sp，即Z02中系統(tǒng)進化樹中比對的Pleospora sp。本研究發(fā)現(xiàn)的致病菌形態(tài)描述與Pleospora camelliaeDippen一致，而且致病性測定發(fā)現(xiàn)，Pleospora camelliaeDippen可以侵染茶葉成葉產(chǎn)生褐色斑塊，符合柯赫氏法則，本研究應用形態(tài)學和 rDNA-ITS 序列分析方法，首次鑒定茶格孢腔菌（Pleospora camelliaeDippen）為湖南茶葉褐斑病的病原，為該病害的防控提供了理論依據(jù)。