張慶華　郭婧　宋增?！埿窠堋〗新暋堃?/p>

摘要：為了提升水生動物醫(yī)學專業(yè)實驗課的質量，在《水生動物病原微生物學實驗》中進行改革探索，設計了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實驗”的案例，鞏固了學生對“科赫法則”的理解和運用。該實驗項目極大地提高了學生的動手能力和實驗興趣，取得了良好的教學效果。

關鍵詞：水生動物病原微生物學實驗；科赫法則；綜合性實驗；實驗改革

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2018）21-0271-02

一、引言

“水生動物醫(yī)學”（090604TK）是2013年被教育部首次批準于上海海洋大學的水產(chǎn)學大類下設置的新本科專業(yè)，為國內首個水生動物疾病防控領域的本科專業(yè)?！端鷦游锊≡⑸飳W實驗》是針對“水生動物醫(yī)學”新專業(yè)開設的專業(yè)必修課程之一，其理論課是《水生動物病原微生物學》。為了滿足市場對水生動物醫(yī)學專業(yè)人才極其匱乏的需求，《水生動物病原微生物學實驗》承載著該專業(yè)重要的專業(yè)技能訓練使命[1]。該課程從無到中有，經(jīng)歷了逐步完善的過程，為了提升該專業(yè)綜合性大實驗的比例，提高學生的綜合性大實驗的技能，我們設計了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定”綜合性大實驗的案例。歷經(jīng)4年的實施與改革，取得了很好的實驗效果，對進一步深化教學改革具有重要借鑒意義。

二、實驗設計的理念

參考《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法GB/T 18652-2002》（2002-02-19發(fā)布2002-05-01實施，中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布）的標準，在《水生動物病原微生物學實驗》專業(yè)微生物學實驗環(huán)節(jié)，針對病原菌部分的教學重點，根據(jù)“科赫法則”設立了“嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽及病原菌的分離、鑒定綜合性大實驗”，旨在建立病原菌的感染模型，鍛煉學生分離、鑒定以及保藏病原菌的綜合能力。訓練學生靈活運用理論知識的能力，融合前面單獨實驗項目中的操作技巧，綜合運用到本實驗項目中，進一步鍛煉學生的團結協(xié)作能力。

三、實驗目的和要求

通過致病性嗜水氣單胞菌人工感染異育銀鯽，了解細菌的培養(yǎng)及人工感染方法；觀察嗜水氣單胞菌感染魚體后所造成的疾病癥狀，包括體表以及體內的病理變化特征；掌握病原菌的體外及體內分離、培養(yǎng)方法，掌握細菌傳統(tǒng)鑒定及16S rRNA分子鑒定方法，理解科赫法則，訓練病原菌保藏的技術。以4-5人為一組，分6個學時進行。

四、實驗內容和方法

1.實驗器材：培養(yǎng)皿、干燥箱、滅菌鍋；塑料水族箱（90L）、加熱棒、充氣泵、解剖刀、解剖盤、剪刀、鑷子、酒精燈、接種環(huán)、酒精棉、1mL無菌注射器、試管、火柴、一次性手套、橡膠手套、口罩；營養(yǎng)瓊脂、無菌脫纖維羊血、血瓊脂基礎培養(yǎng)基、RS瓊脂、無菌生理鹽水、MS-222麻醉劑。

2.實驗菌株：實驗室保藏致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilia，Ah），菌株編號Ah-js16。

3.實驗原理：本綜合性試驗項目設計的原理依據(jù)科赫法則（Koch postulates），又稱證病律。

4.實驗操作步驟：（1）實驗準備：包括實驗魚的馴養(yǎng)和實驗菌株的活化和擴大培養(yǎng)。（2）人工感染：實驗魚人工感染方法包括浸泡、創(chuàng)傷感染、肌肉注射以及腹腔注射，本實驗采用腹腔注射，感染快速、效果較好。感染后，觀察并記錄發(fā)病情況。（3）病原菌的分離、培養(yǎng)：分別觀察記錄人工感染后4 h、8 h、16 h、24 h魚體癥狀，之后進行病魚的解剖及病原菌的平板劃線分離。（4）病原菌鑒定：細菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)鑒定和現(xiàn)代分類鑒定兩種方法。本實驗采用的傳統(tǒng)鑒定方法包括：生長特性、菌落特征、革蘭氏染色、運動性、氧化酶、吲哚試驗、糖發(fā)酵實驗、細菌的致病性檢查共8個項目。細菌的現(xiàn)代分類鑒定采用16S rRNA序列測定，操作簡單（菌液直接送公司進行測序），節(jié)省時間，花費低廉（30-50元/菌株）。根據(jù)測序結果構建系統(tǒng)進化樹，登陸NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），再次確認其分類地位。（5）實驗魚及菌株處理：實驗解剖后的感染魚及分離菌株應進行無害化處理，先經(jīng)121℃滅菌15min后，再進行后續(xù)處理。（6）病原菌的保藏：將分離鑒定后的病原菌株，進行液體擴大培養(yǎng)，之后按照甘油：菌懸液=3∶7的比例，進行混合，之后分裝1-2ml菌種凍存管，9管/株，分別置于-20℃，-70℃，-196℃（每個溫度各3管）進行保存、備用。

五、實驗考核方法

綜合學生之間互動的積極性、實驗小組的團隊協(xié)作精神、實驗報告中體現(xiàn)出來的應用所學知識分析和解釋實驗結果的能力給出該組的成績，分為優(yōu)、良、中、及格、不及格五級。

六、學生對實驗的評價與反饋

通過該綜合性大實驗，學生牢固強化了微生物學的基本操作技巧，對于無菌操作能夠貫穿實驗的全過程，對于“病原微生物”的理解更加透徹，對于“科赫法則”十分清楚。下面僅舉2例，展示學生的實際收獲及實驗效果。

例1：“本次實驗相對比較成功，組內同學彼此配合默契，分工明確，通過此次實驗有利于培養(yǎng)對病原微生物學的興趣，對同學們的獨立思考能力是一個非常好的鍛煉機會?！?/p>

例2：“這學期的水生動物病原微生物實驗已經(jīng)結束，這是我們第一次接觸到微生物的真實世界，開始實驗之前我以為這個實驗不會很難，但是通過本實驗的逐步完成發(fā)現(xiàn)這個課程很有技術含量。不僅需要理論知識作為鋪墊，還需要有嚴謹?shù)膶嶒灳瘛Ｍㄟ^這次實驗操作，我們學到了很多，非常有收獲?！?/p>

七、總結和提高

該綜合性大實驗，確立了以學生為中心的互動實驗教學模式[2]，明顯提高了實驗教學的質量和學生的綜合素質，提升了教學團隊的整體實力。學生的實驗報告圖文并茂，很多照片也成為科學出版社的待出版教材《水生動物病原微生物學實驗》的素材，因此，對同行有一定的參考和幫助。今后如何面對高等教育現(xiàn)代化對課程內涵不斷提升的需求，培養(yǎng)具有國際競爭力的人才，仍需要更多的思考和實踐。希望此實驗案例能夠拋磚引玉，與同道共勉。

參考文獻：

[1]張慶華，宋增福，郭婧，等.“水生動物病原微生物學”實驗的教學與實踐[J].實驗科學與技術，2016，14（6）：130-133，245.

[2]梅蕓，楊華山.以學生為中心的互動實驗教學模式探索[J].實驗科學與技術，2014，12（2）：111-113.