明膠-殼聚糖組織工程神經(jīng)支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相容性研究

陳晚華 卜冰倩 周權(quán) 常臻 張軍東 吳劍英

摘 要 目的：觀察明膠-殼聚糖神經(jīng)支架材料與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞相容性。方法：將明膠-殼聚糖組織工程神經(jīng)支架材料或浸提液與SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，以體積分?jǐn)?shù)10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照組。觀察細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)存活情況。結(jié)果：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)5、7 d，實(shí)驗(yàn)組吸光度值高于對(duì)照組（P<0.05）；掃描電鏡觀察結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在明膠-殼聚糖組織工程神經(jīng)支架材料上生長(zhǎng)良好。結(jié)論：明膠-殼聚糖組織工程神經(jīng)支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的相容性，可作為優(yōu)良的載體用于構(gòu)建人工仿生神經(jīng)。

關(guān)鍵詞 殼聚糖 組織工程 間充質(zhì)干細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q813.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）11-0089-04

Study on the compatibility of mesenchymal stem cells with the gelatin-chitosan tissue engineering nerve scaffold material CHEN Wanhua1*， BU Bingqian1， ZHOU Quan2， CHANG Zhen1， ZHANG Jundong2， WU Jianying2**（1. Shanghai Medical Absorption Bio-Material Innovation and Transformation Promotion Center， Shanghai 200052， China；2. Shanghai Haohai Biological Technology Co.， LTD.， Shanghai 200030， China）

ABSTRACT Objective： To observe the cellular compatibility of gelatin-chitosan nerve scaffold material with rat bone marrow mesenchymal stem cells. Methods： The gelatin-chitosan nerve tissue engineering scaffold material or leaching solution with SD rat bone marrow mesenchymal stem cell co-culture was taken as an experimental group and bone marrow mesenchymal stem cells incubated in 10% FBS nutrient solution as a control group. The growth and survival of cells on scaffold materials were observed. Results： MTT assay results showed that absorbance value of the experimental group was higher than that of the control group after 5 and 7 days of co-cultivation （P<0.05）. Scanning electron microscopy observations showed that bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the gelatin-chitosan tissue engineering scaffolds. Conclusion： Gelatin-chitosan tissue engineered nerve scaffolds have good compatibility with bone marrow mesenchymal stem cells， and can be used as a good carrier to construct artificial bionic nerve.

KEy WORDS chitosan； tissue engineering； mesenchymal stem cell

目前，周圍神經(jīng)的損傷及修復(fù)仍然是尚未解決的全球性醫(yī)學(xué)難題。對(duì)于短節(jié)段（<30 mm）神經(jīng)損傷，手術(shù)可以直接吻合損傷的神經(jīng)殘端，使近端神經(jīng)纖維能夠朝向遠(yuǎn)端發(fā)育生長(zhǎng)。然而，對(duì)于長(zhǎng)節(jié)段（>30 mm）的神經(jīng)缺損，手術(shù)無(wú)法進(jìn)行無(wú)張力直接縫合，國(guó)際上治療“金標(biāo)準(zhǔn)”是將未損傷的非重要區(qū)域的自體神經(jīng)移植到受損傷區(qū)來(lái)修復(fù)橋接損傷的神經(jīng)[1-2]。但是，臨床上手術(shù)應(yīng)用自體神經(jīng)移植受到各種限制：供區(qū)需進(jìn)行二次手術(shù)；供區(qū)神經(jīng)來(lái)源不足，造成繼發(fā)的醫(yī)源性供區(qū)神經(jīng)功能喪失以及供區(qū)神經(jīng)在組織的結(jié)構(gòu)和尺寸的大小上與需修補(bǔ)神經(jīng)匹配不良等問(wèn)題。運(yùn)用組織工程學(xué)方法制備組織工程移植物修復(fù)橋接長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損獲得越來(lái)越多的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)在既往廣泛研究的明膠-殼聚糖組織工程材料的基礎(chǔ)上[3-4]，成功制備了高仿真明膠-殼聚糖神經(jīng)支架材料。在此基礎(chǔ)上添加了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建人工仿生神經(jīng)，探討此材料與細(xì)胞的生物相容性。

1 材料和方法

1.1 明膠-殼聚糖導(dǎo)管的制備

1.1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

明膠（生物級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；Alpha 2-德國(guó)Christ實(shí)驗(yàn)室工藝?yán)鋬龈稍餀C(jī)（長(zhǎng)春寶辰科技發(fā)展有限公司）；殼聚糖（脫乙酰度95%，美國(guó)Sigma公司）；冰醋酸、氫氧化鈉、碳酸鉀、氯化鈉均為市售分析純。試劑及儀器：α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)0.25%乙二胺四乙酸胰蛋白酶消化液、MTT、二甲基亞砜（武漢博士德生物工程有限公司）；神經(jīng)生長(zhǎng)因子3（海特生物制藥股份有限公司）。

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)From Scientific公司）；SW-CJIFD型凈化工作臺(tái)（萬(wàn)凈集團(tuán)安泰公司）；IX-70型倒置相差顯微鏡、JSM-5610LV型掃描電鏡（日本Olympus公司）。ZQPW-70恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）；ELx800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.1.2 明膠-殼聚糖懸濁液的制備

將明膠溶于去離子水后在40 ℃水浴加熱，配成10%明膠溶液；將殼聚糖溶于2%的醋酸溶液中制備成2%的殼聚糖溶液。將兩種溶液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)明膠-殼聚糖=4∶6的比例混合，既往研究顯示，明膠/殼聚糖在4/6比例時(shí)，吸濕性較好，同時(shí)具有較好的拉伸強(qiáng)度[4]。然后再次放入40 ℃水浴中攪拌混勻，同時(shí)加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子3，靜置24 h。將制備成功的懸濁液緩慢注入內(nèi)徑為10 mm、外徑為12 mm、長(zhǎng)200 mm的硅膠套管中，用鉛絲嚴(yán)密密封兩端。

1.1.3 明膠-殼聚糖懸濁液注模成型

采用冷淋技術(shù)，將注模成功的樣品緩慢浸入深低溫冷淋劑（液氮）中，當(dāng)完全浸入液面后保留30～60 min，再放入-80 ℃冰箱中保留30～60 min。使混懸液中沉淀物周圍形成連續(xù)、相互溝通的溶劑冰晶網(wǎng)架構(gòu)。

1.1.4 冷淋干燥成形處理

將制備成功的200 mm長(zhǎng)的明膠-殼聚糖懸濁液的硅膠管冷凍體，精確切成30 mm短節(jié)段，放置于預(yù)冷好的鋁彎盤中，置入Alpha 2冷凍干燥機(jī)，在-60 ℃、1×104 pa下冷凍干燥24 h。支架中的溶劑冰晶發(fā)生升華，得到具有微孔結(jié)構(gòu)的支架架構(gòu)。真空狀態(tài)下升溫至0 ℃并維持6 h，繼續(xù)升溫至22 ℃維持30～60 min，解除真空狀態(tài)，最后升至常溫，即可制得干燥成形的高仿真明膠-殼聚糖支架材料。

1.2 支架材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相容性

1.2.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)4周齡雄性SD大鼠4只，中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量許可編號(hào)：SCXK（滬）2015-0012，體質(zhì)量180～200 g。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1）明膠-殼聚糖支架材料浸提液的制備 取支架材料100 mg裝入15 ml離心管，然后加入3 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。將離心管置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱于100 r/min培養(yǎng)24 h后取出浸提液，按1∶9稀釋比例加入α-MEM培養(yǎng)液內(nèi)混勻，浸提液制備過(guò)程確保無(wú)菌。

2）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，抽取SD大鼠骨髓，置于無(wú)菌離心管中，1 120 g離心10 min后，棄上清液，重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L。以1.5×107接種量接種于25 ml培養(yǎng)瓶（含培養(yǎng)液15 ml）中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。24 h后換液，平均每3 d換液1次，至細(xì)胞基本鋪滿瓶底后用2.5 g/L胰酶消化，按1∶2比例傳代，進(jìn)行擴(kuò)增、純化培養(yǎng)[5]。

3）MTT法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性 取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以5×107/L細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)液為3 ml，細(xì)胞數(shù)為1.5×105。實(shí)驗(yàn)組加明膠-殼聚糖支架材料浸提液0.2 ml，對(duì)照組加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液0.2 ml，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下孵育。隔天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)7 d。分別取培養(yǎng)1，3，5，7 d細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)[6-7]，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4）掃描電鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在材料表面的生長(zhǎng)情況 將無(wú)菌的明膠-殼聚糖支架材料剪成12孔培養(yǎng)板孔洞大小，與細(xì)胞濃度為1×109/L骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共置于12孔培養(yǎng)板中、37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下孵育。將培養(yǎng)7 d后的材料取出，PBS沖洗3次，體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛4 ℃固定1 h。用體積分?jǐn)?shù)30%，0%，75%，80%，90%，100%叔丁醇脫水，前4級(jí)脫水各1次，每次10 min，后2級(jí)脫水各2次，每次10 min。保留樣本內(nèi)叔丁醇于-20 ℃冷凍4 h，真空生華干燥2 h；噴金，在掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

5）主要觀察指標(biāo) 與明膠-殼聚糖支架材料或浸提液共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況、細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種后24 h內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞大多呈圓形，72 h后多數(shù)細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核較大，扁圓形。經(jīng)過(guò)3代培養(yǎng)后得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，融合后排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀結(jié)構(gòu)（圖1）。

2.2 明膠-殼聚糖支架材料浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的影響

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與明膠-殼聚糖支架材料浸提液共培養(yǎng)72 h后，呈典型神經(jīng)細(xì)胞樣改變，有兩個(gè)或多個(gè)突起，細(xì)胞突起之間相互連接成網(wǎng)狀，胞質(zhì)回縮，胞體呈多角形或不規(guī)則形，折光性明顯增強(qiáng)（圖2）。

2.3 明膠-殼聚糖支架材料浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活力的影響

實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞吸光度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)后第5、7 天，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值明顯高于對(duì)照組（P<0.05，表1）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根據(jù)吸光度值描繪的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值逐漸增大，表明細(xì)胞活性逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組吸光度值明顯大于對(duì)照組，即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性高于對(duì)照組（圖3）。表明明膠-殼聚糖支架材料浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)毒性作用，同時(shí)，能顯著增加細(xì)胞活性。

2.4 明膠-殼聚糖支架材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

掃描電鏡觀察見(jiàn)共培養(yǎng)7 d，明膠-殼聚糖支架材料部分降解，其表面細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體積較大，胞體發(fā)出多個(gè)突起，并且細(xì)胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀，其軸突較長(zhǎng)而且較粗，呈典型神經(jīng)元樣細(xì)胞表現(xiàn)（圖3），說(shuō)明其降解產(chǎn)物無(wú)細(xì)胞毒性，支架材料釋放的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用，細(xì)胞相容性良好。

3 討論

目前，周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)仍是醫(yī)學(xué)界面臨的巨大難題。對(duì)于長(zhǎng)段、粗大的神經(jīng)缺損，臨床上主要采用自體神經(jīng)移植以恢復(fù)患肢功能[5]。然而，此法會(huì)造成供體神經(jīng)支配區(qū)感覺(jué)、功能障礙，且自體神經(jīng)來(lái)源有限。組織工程學(xué)研究為解決這一問(wèn)題提供了新思路。種子細(xì)胞和導(dǎo)管支架制成的復(fù)合體是構(gòu)建組織工程的核心[6]，構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[7-8]。

組織工程中研究較多的種子細(xì)胞有：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞等[8]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多相分化潛能，可誘導(dǎo)分化為類雪旺細(xì)胞，在體外可形成髓鞘磷脂成分，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[10-12]。Cuevas等[9，13]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入5 mm的坐骨神經(jīng)缺損處，于術(shù)后18～180 d分別檢測(cè)神經(jīng)功能恢復(fù)與細(xì)胞表型的變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后18 d神經(jīng)功能恢復(fù)了36%，33 d恢復(fù)了78%，180 d恢復(fù)了96%，證實(shí)種子細(xì)胞可以有效的修復(fù)神經(jīng)損傷。未來(lái)對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和功能的模擬、重建以及神經(jīng)移植等將是研究的重點(diǎn)。

目前，應(yīng)用于臨床的組織工程神經(jīng)導(dǎo)管分為可降解型和非可降解型[14]，包括：生物型神經(jīng)導(dǎo)管、人工合成導(dǎo)管、復(fù)合組織導(dǎo)管。Takagi等[7]研究表明，神經(jīng)再生和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用關(guān)系密切，當(dāng)神經(jīng)缺損超過(guò)一定距離后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的缺乏，導(dǎo)致神經(jīng)殘段不能重新連接。黃繼鋒等[16-17]用精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損，結(jié)果顯示神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)坐骨神經(jīng)缺損具有良好的橋梁作用，并能促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)。理想的組織工程神經(jīng)支架材料要有良好的生物相容性、可降解性、可塑性以及一定的機(jī)械強(qiáng)度[15，18-20]。研究者們希望在神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)添加干細(xì)胞、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及內(nèi)部支架結(jié)構(gòu)組成復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管用于更長(zhǎng)段距離的神經(jīng)缺損。

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