李 龍，劉鎖珠，王宏輝，董 瀅

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000)

益生菌被定義為“當(dāng)攝入充足數(shù)量時(shí)對(duì)動(dòng)物健康發(fā)揮有益的活的微生物的總稱(chēng)”[1]。益生菌作為一種綠色、安全的微生態(tài)制劑已廣泛地用于動(dòng)物生產(chǎn)中，國(guó)內(nèi)外有關(guān)其應(yīng)用效果的報(bào)道也很多。大量研究表明日糧添加益生菌能夠改善肉雞生產(chǎn)性能[2]，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率[3]，抑制腸道致病菌生長(zhǎng)[4]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[5]。但目前關(guān)于益生菌對(duì)高海拔缺氧環(huán)境下肉雞生產(chǎn)性能的影響還未見(jiàn)報(bào)道，因此本試驗(yàn)旨在研究益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能、腸道消化酶活性和腸道形態(tài)的影響，為后期益生菌在高原肉雞生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌菌粉的制備

試驗(yàn)中所用的益生菌(LactobacillusplantarumJM113)菌株是從健康藏雞腸道中分離獲得，該菌株具有較好的耐酸耐膽鹽特性、粘附特性和抑菌效果。益生菌菌粉制備過(guò)程參照文獻(xiàn)[6]提供的方法進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 270只1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞，試驗(yàn)期42 d。試驗(yàn)期內(nèi)肉雞飼喂全價(jià)商品日糧，1～21日齡飼喂前期日糧，22～42日齡飼喂后期日糧。3個(gè)處理組分別為：(1)對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；(2)抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加金霉素(添加劑量為50 mg/kg)；(3)益生菌組在基礎(chǔ)日糧中添加Lactobacillus plantarum JM113菌粉(添加劑量為109CFU/kg)。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)在西藏林芝地區(qū)西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地(海拔 2986 m)進(jìn)行，所有試驗(yàn)雞飼養(yǎng)在 3 層金屬雞籠內(nèi)，每個(gè)處理 6個(gè)雞籠，每個(gè)雞籠 15只雞，前期(1～21 d)飼養(yǎng)密度為 15 只/m3，后期飼養(yǎng)密度為 7.5 只/m3，試驗(yàn)期內(nèi)雞自由采食和飲水。第 1 周雞舍溫度為 30～33 ℃，之后逐漸降低，3周后溫度保持在 23～25 ℃。 每天23 h 照明， 1 h熄燈。消毒和免疫程序按常規(guī)程序進(jìn)行。

1.3 生產(chǎn)性能測(cè)定

在試驗(yàn)期1 d，21 d和42 d分別稱(chēng)量每個(gè)重復(fù)雞只的總重量和總采食量，并計(jì)算平均日采食量ADFI和飼料轉(zhuǎn)化率FCR。

1.4 樣品采集和測(cè)定

1.4.1 腸道形態(tài) 在21和42日齡每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只雞，頸靜脈放血處死后解剖，剪取十二指腸端部，放入裝有4%福爾馬林的棕色瓶中固定，收取剩余十二指腸中的內(nèi)容物，迅速放于-20 ℃冰箱保存。固定的十二指腸利用冰凍切片機(jī)制備厚度成6 μm的冰凍切片，HE染色，電子顯微鏡下(40倍)測(cè)定腸絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值(V/C)，每個(gè)樣品選擇10個(gè)不同典型視野，每個(gè)視野絨毛高度和隱窩深度分別測(cè)定10個(gè)數(shù)值。腸道內(nèi)容物在測(cè)定前用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋并勻漿，離心，保留上清液。通過(guò)試劑盒測(cè)定上清液中的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性(南京建成生物工程研究所)，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 微生物群落分析 無(wú)菌采集肉雞盲腸內(nèi)容物，利用糞便DNA提取試劑盒(OMEGA)提取肉雞盲腸內(nèi)容物菌群總基因組DNA，采用特異性引物對(duì)肉雞盲腸中總菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。將含有特定菌群16S rRNA基因的質(zhì)粒從 1×103～1×109(copies / mL)逐級(jí)稀釋構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量采用采用25 μL反應(yīng)體系，其中SYBR Premix (Takara) 12.5 μL，上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，滅菌水9.5 μL，模板2 μL。每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的含量以菌群/總菌來(lái)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，Dancan法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表1 特定菌群熒光定量引物[7-8]Table 1 Fluorescent quantitative primer for specific bacteria flora

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加益生菌或抗生素對(duì)肉雞生長(zhǎng)前期(0～21日齡)的BW、ADFI和FCR均無(wú)顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，益生菌顯著提高了生長(zhǎng)后期的BW(P<0.05)，且與抗生素組差異不顯著(P>0.05)。益生菌組和抗生素組肉雞生長(zhǎng)后期的FCR均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。生長(zhǎng)后期各組之間FCR差異不顯著(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effect of probiotics on growth performance of broiler reared at hypoxic environment

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不相同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。
Note: Values with different superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05), the same superscripts insignificant difference (P>0.05).The same below.

2.2 益生菌對(duì)肉雞腸道消化酶活性的影響

益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞腸道消化酶活性的影響見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，日糧中添加益生菌可以顯著提高21 d肉雞腸道淀粉酶活性(P<0.05)，但是對(duì)胰蛋白酶和脂肪酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。42日齡肉雞腸道中淀粉酶活和脂肪酶活性均顯著高于對(duì)照組和抗生素組(P<0.05),但對(duì)照組與抗生素組在3種消化酶活性上均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞腸道消化酶活性的影響Table 3 Effect of probiotics on digestive enzyme activity of broiler reared at hypoxic environment IU/mL

2.3 益生菌對(duì)肉雞十二指腸形態(tài)的影響

益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞十二指腸形態(tài)的影響見(jiàn)表4。相比于對(duì)照組和抗生素組，益生菌處理組顯著提高了21 d和42 d肉雞絨毛長(zhǎng)度和V/C比值(P<0.05)。與對(duì)照組相比，抗生素處理組在絨毛高度、隱窩深度和V/C比值上均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.4 益生菌對(duì)肉雞盲腸微生物群落的影響

由表5可見(jiàn)，相比于對(duì)照組，抗生素處理組顯著降低了肉雞盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌含量(P<0.05)，益生菌處理組顯著提高了乳酸桿菌含量(P<0.05)，并顯著降低了大腸桿菌和沙門(mén)氏菌含量(P<0.05)。益生菌處理組肉雞盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌含量顯著高于抗生素處理組(P<0.05)。

表4 益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞十二指腸腸道形態(tài)的影響Table 4 Effect of probiotics on intestine structure of broiler reared at hypoxic environment μm

表5 益生菌對(duì)高原缺氧條件下肉雞盲腸菌群組成的影響Table 5 Effect of probiotics on microbiota composition of broiler reared at hypoxic environment

3 討 論

在本研究中，益生菌對(duì)肉雞生長(zhǎng)前期(0～21日齡)的生產(chǎn)性能沒(méi)有顯著影響。在生長(zhǎng)后期(22～42日齡)，抗生素和益生菌均顯著地改善了FCR，提高了肉雞42日齡體重，且益生菌與金霉素具有相似的效果。Peng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加益生菌顯著提高了生長(zhǎng)后期的平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。而Shokryazdan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加益生菌顯著提高肉雞42日齡體重和生長(zhǎng)后期的飼料轉(zhuǎn)化率。不同的益生菌飼養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)定的生產(chǎn)性能存在差異，這可能是不同試驗(yàn)使用的菌株、計(jì)量、飼喂方式等存在差異造成的。本試驗(yàn)中益生菌提高肉雞42日齡體重和降低飼料轉(zhuǎn)化率可能與腸道淀粉酶活性和脂肪酶活性的增加、改善腸道形態(tài)有關(guān)。消化酶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化是動(dòng)物吸收營(yíng)養(yǎng)的第一步，其活性高低直接影響動(dòng)物對(duì)日糧的利用效果，進(jìn)而影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能。腸道中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性的高低直接反應(yīng)了機(jī)體對(duì)淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)消化能力[11]。生長(zhǎng)后期是肉雞脂肪沉積的主要階段，同時(shí)肉雞對(duì)能量的需要量也大幅增加，因此脂肪酶活性和淀粉酶活性的高低直接關(guān)系到脂肪沉積量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以顯著提高42日齡的十二指腸淀粉酶活和脂肪酶，而抗生素對(duì)消化酶的酶活沒(méi)有顯著影響。Li 等[12]發(fā)現(xiàn)，益生菌可以顯著增加肉雞腸道中的脂肪酶活性。Sun 等[13]和Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，給肉雞飼喂含有益生菌的日糧后腸道中的脂肪酶和蛋白酶活性顯著提高，但益生菌對(duì)淀粉酶活性無(wú)影響。不同的益生菌菌株產(chǎn)酶活性存在差異，這可能是各研究結(jié)果不盡相同的主要原因。

益生菌促生長(zhǎng)的另一個(gè)主要原因是改善動(dòng)物機(jī)體的腸道形態(tài)，其中小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位。小腸的吸收能力與腸絨毛高度和隱窩深度有密切關(guān)系。腸絨毛越長(zhǎng)，表面積越大，越有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而隱窩深度反應(yīng)腸細(xì)胞的生成速度，研究中常以V/C作為腸絨毛吸收能力的綜合指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，在21 d和42 d，添加益生菌均能顯著提高肉雞的腸絨毛高度和V/C。Shokryazdan等[10]研究表明，日糧添加益生菌可以顯著提高V/C。 Wang等[14]研究表明，益生菌可以顯著提高肉雞絨毛高度和V/C。而益生菌改善腸道結(jié)構(gòu)的原因目前發(fā)現(xiàn)有三種：(1)益生菌的中間代謝產(chǎn)物或特殊酶系能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)[15]；(2)抑制病原菌從而保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受病原菌的損傷[16]，在本試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)益生菌能夠增加腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌含量，降低有害菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌含量；(3)益生菌會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(特別是丁酸)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分裂[17]。雖然本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)益生菌能夠提高肉雞腸絨毛高度和V/C比值，但其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

此外，益生菌還可能通過(guò)別的途徑提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而改善生產(chǎn)性能。益生菌提高生產(chǎn)性能可能有以下原因：(1) 某些益生菌可以分泌一些胞外消化酶包括淀粉酶，從而補(bǔ)充腸道消化酶，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率[18]；(2) 益生菌可能會(huì)刺激腸道細(xì)胞分泌更多的內(nèi)源酶，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化；(3) 益生菌在肉雞體內(nèi)能夠黏附著在淀粉顆粒上，促進(jìn)淀粉的消化；(4) 益生菌產(chǎn)生有機(jī)酸，一般消化酶的最適pH為偏酸性，而有機(jī)酸的產(chǎn)生可加強(qiáng)腸道的蠕動(dòng)和胃液分泌，進(jìn)而促進(jìn)消化吸收，增強(qiáng)消化酶活性[19]。本研究中雖然金霉素也可以提高肉雞的生產(chǎn)性能，但是對(duì)金霉素對(duì)消化酶活和腸道形態(tài)均沒(méi)有顯著影響。金霉素提高肉雞生產(chǎn)性能主要是通過(guò)減少腸道微生物或改變腸壁厚度實(shí)現(xiàn)的?？紤]到抗生素濫用會(huì)對(duì)動(dòng)物和環(huán)境帶來(lái)一系列負(fù)面影響，而益生菌具有安全無(wú)污染的特性，因此益生菌可以作為高海拔地區(qū)肉雞飼料添加劑。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，益生菌可以提高高海拔缺氧條件下肉雞消化道中消化酶活性，改善腸道形態(tài)，從而提高生產(chǎn)性能，因此益生菌可能作為高海拔缺氧條件下肉雞日糧的一種添加劑。