關(guān)于BnTR1基因抑制不同分化程度的腫瘤細(xì)胞增殖的初步探討

向俊蓓 萬(wàn)謙

摘 要：為研究耐熱基因BnTR1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，構(gòu)建BnTR1條件表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染4種不同分化程度的腫瘤細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示BnTR1的表達(dá)水平在幾種腫瘤細(xì)胞中相近；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示HGC和AGS的細(xì)胞增殖受到抑制，抑制作用HGC > AGS，而HT-29和MCF-7的細(xì)胞增殖不受到抑制。推斷BnTR1對(duì)于分化程度低的腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用，而對(duì)于分化程度高的腫瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制。

關(guān)鍵詞：BnTR1 腫瘤啟動(dòng)子 腫瘤細(xì)胞的分化程度

中圖分類號(hào)：S853.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2018）3（a）-0000-00

BnTR1基因（GU204975.1）來源于甘藍(lán)型油菜 [1]，在植物中的功能包括抗熱脅迫、抗鹽脅迫等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)BnTR1對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺癌細(xì)胞A549的增殖具有抑制作用，該抑制作用可以與抗癌化學(xué)藥物順鉑cisplatin對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的增殖抑制作用協(xié)同[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BnTR1編碼一種泛素系統(tǒng)的E3連接酶，能對(duì)多種蛋白質(zhì)包括某些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行泛素化[1，3-5]； BnTR1發(fā)揮抗脅迫功能和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能，必須有其N端蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的RING結(jié)構(gòu)域的存在[1，5]。由于人腫瘤細(xì)胞按不同標(biāo)準(zhǔn)可以分成許多不同類型，包括按分化程度的不同，可以大致劃分為未分化、低分化和高分化，而其惡性程度的排序是：未分化>低分化>高分化。同時(shí)，不同分化程度的腫瘤細(xì)胞對(duì)于干預(yù)作用的反應(yīng)是有差異的。因此，BnTR1能夠抑制人腫瘤細(xì)胞增殖的特性值得深入研究。

基于此目的，研究中構(gòu)建BnTR1條件表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染多種腫瘤細(xì)胞（人胃癌細(xì)胞HGC（未分化腫瘤細(xì)胞）、人胃癌細(xì)胞AGS（低分化腫瘤細(xì)胞）、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29（高分化的腫瘤細(xì)胞）、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7（高分化的腫瘤細(xì)胞））后，分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)和MTT檢測(cè)，分析TR1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)的聯(lián)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 條件表達(dá)載體構(gòu)建

（1）全基因合成人腫瘤基因c-ErbB-2的啟動(dòng)子序列，在5末端加上限制性內(nèi)切酶AflII的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，同時(shí)在3末端加上限制性內(nèi)切酶BamHI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。利用基因克隆技術(shù)，將合成的全基因序列整合到pcDNA 3.1（+）上的AflII和BamHI的酶切位點(diǎn)之間，備用；高保真PCR酶擴(kuò)增BnTR1全cDNA片段，并且分別在5端和3端加上BamHI和EcoRI序列和保護(hù)堿基，同時(shí)在5端BamHI的位點(diǎn)后加入蛋白質(zhì)片段標(biāo)記Flag tag，備用；

（2）利用基因克隆技術(shù)，拼接前述備用DNA片段，構(gòu)建目標(biāo)載體pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1。擴(kuò)增質(zhì)粒中插入BnTR1片段；測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。

1.2 腫瘤細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

分別培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞包括HGC（未分化）、AGS（低分化）、HT-29（高分化）、MCF-7（高分化），并進(jìn)行質(zhì)粒pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染[7]：每種處理6孔重復(fù)，質(zhì)粒pcDNA 3.1（+）做為對(duì)照；

1.3 Western blot檢測(cè)

收獲轉(zhuǎn)染BnTR1的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞并分別提取蛋白質(zhì)混合物，Western blot[8]檢測(cè)BnTR1的表達(dá)。使用兔抗BnTR1血清（自制抗血清）和兔抗人Beta-actin的一抗（中杉金橋，中國(guó)），小鼠抗兔的帶辣根過氧化物酶（HRP）的二抗（中杉金橋，中國(guó)），ECL溶液購(gòu)自碧云天公司。

1.4 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，使用MTT法[9]檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。使用MTT原液（0.5 mg/ml）（Sigma Inc.，USA）；二甲基亞砜DMSO（Sigma Inc.，USA）；

檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為655 nm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每種條件獲得6個(gè)OD570nm的數(shù)據(jù)，去除最高值和最低值，分析中分別對(duì)比轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1（+）-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1（+）的對(duì)照組，使用軟件SPSS 19.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量均值。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

測(cè)序結(jié)果顯示BnTR1條件表達(dá)載體構(gòu)建成功，Western結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，BnTR1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平在HGC、AGC、HT-29和MCF-7中相近。

2.2 不同腫瘤細(xì)胞的增殖情況

HGC和AGS細(xì)胞的增殖受到BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的顯著抑制（P = 0.03和P = 0.02），抑制率分別是17%和10%；而HT-29和MCF-7細(xì)胞的增殖未受到BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的顯著抑制（P = 0.81和P = 0.39）。

3 討論

研究中選擇腫瘤基因c-ErbB-2的啟動(dòng)子，c-ErbB-2是一種腫瘤基因，具有在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的特點(diǎn)。結(jié)果表明不同腫瘤細(xì)胞經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，BnTR1的表達(dá)水平相近，而不同腫瘤細(xì)胞對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的反應(yīng)性有差異。表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于處于未分化程度的HGC和處于低分化程度的AGS的增殖能限制抑制，而對(duì)高分化程度的HT-29和MCF-7的增殖不抑制，分化程度越低，BnTR1的抑制作用越顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道BnTR1能抑制Hela和A549細(xì)胞的增殖[5]，而Hela和A549均為分化程度低的腫瘤細(xì)胞，故本研究結(jié)論為BnTR1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制功能與細(xì)胞分化程度的相關(guān)性提供了新的支撐數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Liu ZB， Wang JM， Yang FX， Yang L， Yue YF， Xiang JB， Gao M， Xiong FJ， Lv D， Wu XJ， Liu N， Zhang X， Li XF， Yang Y. A novel membrane-bound E3 ubiquitin ligase enhances the thermal resistance in plants. Plant Biotechnol.J.，2014，12（1）：93-104.

[2] 陳彩麗，曹昊昊，樊莉娟，等.過量表達(dá)BnTR1油菜對(duì)多種逆境的抗性分析.四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，54（1）：215-220.

[3] Qian Wan， Zhibin Liu， Wenzhen Peng， Jianmei Wang， Xufeng Li， Yi Yang. BnRCH gene inhibits cell growth of Hela cells through increasing the G2 phase of cell cycle.Human Cell，2011，240：150-160.