陳方圓，馬麥燕，張相鋒，馬正海，焦子偉

(1.伊犁師范學(xué)院生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)是一種珍貴的藥(食)用真菌，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，主要有蟲草素、腺苷等成分組成。蟲草素(Cordycepin)具有抗菌性[1-2]，抗腫瘤[3]，在促進(jìn)脾臟質(zhì)量增加，提升肝臟核酸、蛋白質(zhì)更新速度等方面也有一定的作用[4-5]。腺苷(Adenosine)也是核苷類的一種，其具有抑制中樞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、改善心腦血液循環(huán)等作用[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】加速溶劑萃取儀(accelerated solvent extraction, ASE)[8-12]，是利用溶劑對(duì)固體、半固體的樣品進(jìn)行萃取[13]。近幾年，在國內(nèi)外均有利用ASE提取天然活性成分的研究，但提取蛹蟲草主要成分蟲草素、腺苷等未見相關(guān)報(bào)道[14-19]。其原理是在高溫、高壓條件下，溶劑粘度降低，分子運(yùn)動(dòng)能力提高，使溶質(zhì)和溶劑分子能夠迅速滲出，并且溶質(zhì)分子更易掙脫基質(zhì)的約束。ASE 技術(shù)一般將目標(biāo)分析物在20 min內(nèi)自動(dòng)從樣品中完成提取，可取代超聲萃取、微波萃取、索氏提取、煮沸法等傳統(tǒng)方法。【本研究切入點(diǎn)】ASE有節(jié)約溶劑[20]、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、提取效果佳等優(yōu)點(diǎn)，且在試驗(yàn)后期上HPLC檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)分析物時(shí)，所獲得的提取液無需再次進(jìn)行濃縮、凈化等過程，直接定容、過膜即可進(jìn)樣分析，簡(jiǎn)短樣品的前處理時(shí)間。研究加速溶劑萃取法提取蛹蟲草主要成分工藝優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問題】選擇該技術(shù)提取蛹蟲草兩種主要成分蟲草素和腺苷，并采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)化。得到加速溶劑萃取法提取蟲草素、腺苷最優(yōu)條件，為選擇最佳提取新疆地區(qū)蛹蟲草主要活性物質(zhì)蟲草素、腺苷方法提供技術(shù)樣本。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

乙醇(C2H50H)，色譜純級(jí)乙腈(C2H3N)，ddH2O等。蛹蟲草子實(shí)體來自本實(shí)驗(yàn)室蛹蟲草人工栽培基地；蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

LC-20AB高效液相色譜儀(日本島津)、ASE加速溶劑萃取儀(戴安中國有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取正交試驗(yàn)，即四因素三水平進(jìn)行優(yōu)化，乙醇濃度分別是：0、20%、40%。萃取溫度70、100、130℃，循環(huán)次數(shù)分別是：1、2、3，靜態(tài)萃取時(shí)間5、10、15 min，計(jì)9個(gè)處理。表1

表1 ASE法提取蟲草素、腺苷正交試驗(yàn)處理
Table 1 Orthogonal experiment ofthe exrtration of cordycepin and adenosine in ASE

處理Treatments溫度(A)Temperature (A) (℃)時(shí)間(B)Time (B) (min)乙醇濃度(C)Ethanol concentration (C) (%)循環(huán)次數(shù)(D)Cycles (D) (次)170501270102023701540341005203510010401610015027130540281301003913015201

1.2.2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品各取10 mg，用流動(dòng)相定容至100 mL，搖勻。分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL母液(100 μg/mL)定容至10 mL，制備不同標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL；并放置4℃冰箱備用。

1.2.3 加速溶劑萃取

將干燥的蛹蟲草子實(shí)體放入粉碎機(jī)中粉碎1 min，過60目的細(xì)篩，將樣品充分混勻后分別稱取蛹蟲草粉末9份4 g，與硅藻泥1∶1混勻，萃取劑選擇乙醇，按表1的處理進(jìn)行ASE萃取，分別收集提取液，離心4 000 r/min，10 min，提取液過0.22 μm濾膜后供HPLC檢測(cè)用。

1.2.4 HPLC檢測(cè)

檢測(cè)條件：色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈∶水(5∶95)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：260 nm紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

將不同梯度的蟲草素和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過標(biāo)樣峰面積制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將被測(cè)提取液分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各處理樣品的蟲草素和腺苷的含量。

1.2.5 計(jì)算公式

樣品中蟲草素或腺苷的量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω計(jì)，單位以毫克每千克(μg/g)表示，按式(1)計(jì)算。

ω=A×ρ×ν×f/(A×m).

(1)

1.3 數(shù)據(jù)處理

研究數(shù)據(jù)處理分析采用EXCEL數(shù)據(jù)整理和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件(Version 11.5，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及和正交分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別稱取蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL各10 μL進(jìn)樣分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性范圍，得出蟲草素的線性回歸方程為Y=32.241X-1.2731，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9；腺苷的線性回歸方程為Y=33.443X-9.066 4，相關(guān)系數(shù)R=0.999 4。表2

2.2 HPLC檢測(cè)蟲草素、腺苷色譜圖

研究表明，A 圖為蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，B至J圖為各處理的色譜圖，各圖中峰a為腺苷的色譜峰，峰c為蟲草素的色譜峰?？梢郧逦闯鎏崛∩V圖中蟲草素、腺苷實(shí)現(xiàn)了基線分離，而且出峰時(shí)間控制得比較好。蟲草素、腺苷標(biāo)樣的保留時(shí)間分別為7.016和9.308 min，蟲草素的出蜂時(shí)間比腺苷的要晚，九個(gè)處理中均產(chǎn)生蟲草素及腺苷，尤其是以蟲草素為主，但因各個(gè)處理的條件不同，而產(chǎn)生蟲草素、腺苷的量各不相同。圖1

表2 蟲草素、腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線
Table 2 Standard curves of cordycepin and adenosine

線性回歸方程Linear regression equation相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient蟲草素CordycepinY=32.241 X-1.273 1R=0.999 9腺苷AdenosineY=33.443 X-9.066 4R=0.999 3

注：A標(biāo)樣；B處理1；C處理2；D處理3；E處理4；F處理5；G處理6；H處理7；I處理8；J處理9，a腺苷；c蟲草素

Note: A, standard samples; B, treatment 1; C, treatment 2; D, treatment 3; E, treatment 4; F, treatment 5; G, treatment 6; H, treatment 7; I, treatment 8; J, treatment 9. a, Adenosine; c, Cordycepin

圖1 HPLC檢測(cè)蟲草素、腺苷色譜
Fig.1 HPLC detection of cordycepin, adenosine chromatogram

2.3 蟲草素提取

研究表明，九組處理得到蟲草素含量各不相同，其中以處理7提取的蟲草素含量最高，為5 611.898 μg/g，處理1、2、3、4、9、5提取的蟲草素含量較低，處理8提取的蟲草素含量最低，為3 360.243 μg/g。從蟲草素提取結(jié)果和正交試驗(yàn)效應(yīng)分析可得，4個(gè)因素影響蟲草素提取率的主次順序?yàn)椋狠腿r(shí)間>乙醇濃度>循環(huán)次數(shù)>萃取溫度，正交分析最優(yōu)組合為A1B1C2D2。即溫度70℃，時(shí)間5 min，乙醇濃度20%，循環(huán)次數(shù)2次。表3，圖2

表3 加速溶劑萃取法提取蟲草素結(jié)果
Table 3 The results of accelerated solvent extraction extraction of cordycepin(μg/g)

處理Treatment溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(min)乙醇濃度Ethanol concentration(%)循環(huán)次數(shù)Cycles(次)蟲草素含量Cordycepin content(μg/g)1705014 446.905270102025 302.780370154034 984.793410052035 361.7935100104013 556.886610015024 054.333713054025 611.898813010033 360.2439130152014 431.650均值1 Mean value 14 911.495 140.23 953.834 145.15均值2 Mean value 24 324.343 458.565 032.074 833.12均值3 Mean value 34 467.934 310.964 717.864 568.94極差 Range587.151 681.641 078.24687.97最優(yōu)水平 Optimal evelA1B1C2D2

圖2 加速溶劑萃取法提取蟲草素正交試驗(yàn)結(jié)果效應(yīng)
Fig.2 Effect of orthogonal experiment ofaccelerated solvent extraction extraction of cordycepin

2.4 腺苷提取

研究表明，九組處理得到腺苷含量也各不相同，以處理8提取的腺苷含量最高，為740.351 μg/g；處理6的次之，處理2、3、4、5、7、9所取的含量較低，處理1提取的腺苷含量最低，為29 μg/g。從腺苷提取結(jié)果和正交試驗(yàn)效應(yīng)分析可得，4個(gè)因素影響腺苷提取率的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?萃取時(shí)間>循環(huán)次數(shù)>萃取溫度，正交分析最優(yōu)組合為A2B2C1D2。即溫度100℃，時(shí)間10 min，乙醇濃度0，循環(huán)次數(shù)2次。表4，圖3

表4 加速溶劑萃取法提取腺苷結(jié)果
Table 4 The results of accelerated solvent extraction extraction of adenosine

處理Treatment溫度Temperature(℃)時(shí)間Time(min)乙醇濃度Ethanol concentration(%)循環(huán)次數(shù)Cycles(次)腺苷含量Adenosine content(μg/g)17050129.00027010202524.1637015403145.5741005203218.272510010401156.49261001502738.8527130540297.09081301003740.351913015201119.237均值1 Mean value 1232.910114.787502.734101.576均值2 Mean value 2371.205473.668287.223453.367均值3 Mean value 3318.893334.553133.051368.064極差 Range138.295358.881369.683351.791最優(yōu)水平 Optimal evelA2B2C1D2

圖3 加速溶劑萃取法提取腺苷正交試驗(yàn)結(jié)果效應(yīng)
Fig.3 Effect of orthogonal experiment of accelerated solvent extraction extraction of adenosine

3 討 論

加速溶劑萃取法是近些年新出現(xiàn)的一種新型提取方法，其原理和CO2超臨界萃取儀相似，該方法更具有操作流程簡(jiǎn)單、全自動(dòng)、溶劑用量少、時(shí)間短、材料前、后期處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[21]。目前不少學(xué)者利用加速溶劑萃取法得到了生物堿、苷類等物質(zhì)，趙恒強(qiáng)等[22]用此法從黃連中提取黃連素(鹽酸小檗堿)并用正交試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，確定該方法適合提取黃連內(nèi)的生物堿，最佳提取條件是：溫度130℃，80% C2H5OH+0.5% HCl 作提取溶劑，靜態(tài)提取10 min，提取1次；石矛等[23]得到人參總皂苷，確定最佳工藝參數(shù)：提取溫度140℃，提取時(shí)間5 min，循環(huán)次數(shù)3次；徐夏葉等[24]研究對(duì)甜葉菊中的萊鮑迪甙A、萊鮑迪甙C、甜菊甙的提取效果，最佳條件是：水作為溶劑，壓力1.03×107Pa ，靜態(tài)萃取10 min，溫度60℃，循環(huán)2次。目前用此方法提取蟲草素、腺苷的研究很少。試驗(yàn)利用加速溶劑萃取法成功提取得到了蟲草素、腺苷，并對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)提取腺苷的最優(yōu)條件是：溫度100℃，時(shí)間10 min，乙醇濃度0，循環(huán)次數(shù)2次，蟲草素的最優(yōu)條件是：溫度70℃，時(shí)間5 min，乙醇濃度20%，循環(huán)次數(shù)2次。此結(jié)果和以上學(xué)者提取苷類最優(yōu)條件相差不大，主要是因?yàn)檐疹愡@類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，都是由糖基和非糖基(苷元)構(gòu)成；溶劑主要使用的是水，因?yàn)樘崛〉倪@類物質(zhì)糖基多，苷元所占比例較少，親水性增加，在水中的溶解性也較強(qiáng)的緣故。該技術(shù)與傳統(tǒng)提取蟲草素、腺苷方法相比也具有明顯優(yōu)勢(shì)，它是利用高壓、高溫的條件下，快速從蛹蟲草中提取出來，并且會(huì)使蟲草素在溶劑中的溶解度和溶出速率大大提高，提取效率增高。加速溶劑萃取蟲草素、腺苷的研究，為提取蟲草素、腺苷增加了選擇方法，但該技術(shù)還需做更多的摸索嘗試，有待進(jìn)一步做深入研究。

4 結(jié)論

通過加速溶劑萃取法提取蛹蟲草兩種主要成分蟲草素和腺苷，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行了提取工藝條件優(yōu)化，得到了加速溶劑萃取法提取蟲草素、腺苷最優(yōu)組合條件。4個(gè)因素影響蟲草素提取率的主次順序?yàn)椋狠腿r(shí)間>乙醇濃度>循環(huán)次數(shù)>萃取溫度，加速溶劑萃取法提取蟲草素的最適條件是：溫度70℃，時(shí)間5 min，乙醇濃度20%，循環(huán)次數(shù)2次。4個(gè)因素影響腺苷提取率的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?萃取時(shí)間>循環(huán)次數(shù)>萃取溫度，加速溶劑萃取法提取腺苷的最適條件是：溫度100℃，時(shí)間10 min，乙醇含量0，循環(huán)次數(shù)2次。