棉秸稈纖維素降解菌系構(gòu)建及固體發(fā)酵條件優(yōu)化

侯 敏，包慧芳，王 寧，詹發(fā)強，楊文琦，侯新強，楊 蓉，龍宣杞，崔衛(wèi)東

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆飼草短缺是限制飼料產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展的瓶頸，利用我區(qū)現(xiàn)有資源，開發(fā)新型優(yōu)質(zhì)飼料原料，是今后飼料研究的重點領(lǐng)域。棉花是新疆的支柱性產(chǎn)業(yè)之一，種植面積約占全國的1/3，棉稈資源相當(dāng)豐富。將棉秸稈資源轉(zhuǎn)化成為粗飼料，木質(zhì)纖維素是最大的限制因素之一，其緊密的晶狀結(jié)構(gòu)[1]很難降解。棉秸稈中纖維素含量占41.0%～42.0%，木質(zhì)素占15.0%～25.0%，半纖維素占17.0%～21.0%，如果解決棉稈纖維素降解難題，將對新疆畜牧業(yè)發(fā)展及提高秸稈轉(zhuǎn)化利用率具有積極的現(xiàn)實意義。【前人研究進展】目前，通常用化學(xué)、物理、生物方法處理秸稈[2]。利用有益微生物[3]降解處理秸稈，能促進纖維素或木質(zhì)素的解聚[4]，提高粗飼料的營養(yǎng)價值。自然狀態(tài)下徹底降解植物棉稈要充分重視多種生物之間的協(xié)同效應(yīng)。魏如騰[5]證明復(fù)合菌降解秸稈的效果比單一菌種要好，纖維素降解率達到34.8%。復(fù)合系由多種處于協(xié)同關(guān)系的微生物組成，其反應(yīng)產(chǎn)物互相利用和中和，形成了較穩(wěn)定的自然循環(huán)系統(tǒng)[6]。崔宗均等[7]保持自然界中菌種之間的協(xié)同關(guān)系，篩選到了一組能夠快速高效分解水稻稻稈的復(fù)合菌系。Kato等[8]通過研究復(fù)合菌系中主要菌株間的關(guān)系，將纖維素降解菌和非纖維素降解菌株組合在一起，發(fā)現(xiàn)非纖維素降解菌對纖維素降解菌起了非常重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于秸稈飼料化研究成果及理論，已得到一批提高棉稈發(fā)酵品質(zhì)的菌株[9-10]。其中有產(chǎn)朊假絲酵母 (Candidautilis)、植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)、糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)、地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)等。著眼于棉秸稈飼料化的難點：木質(zhì)纖維素，篩選適用的纖維素降解菌，并結(jié)合已篩選得到的提高發(fā)酵品質(zhì)的菌株，構(gòu)建一組結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定、對外環(huán)境變化抗逆性強、提高適口性的降解復(fù)合菌劑。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過微生物預(yù)處理棉秸稈，研究棉秸稈中纖維素降解，為高效降解復(fù)合菌劑在棉秸稈飼料化中的開發(fā)利用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秸稈

由新疆宏瑞達纖維有限公司提供，棉秸稈進行揉絲處理，切割成2.0 cm左右，用于發(fā)酵。

1.1.2 樣品

棉花種植地土壤；牛、羊、駱駝新鮮糞便。

1.1.3 菌株

產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)等菌株有新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所提供。

1.1.4 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基見《微生物學(xué)實驗技術(shù)》[11]。

剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基[12]：結(jié)晶纖維素 1.880 g，KH2PO40.500 g，明膠 2.000 g，MgSO40.250 g，瓊脂 14.000 g，剛果紅 0.200 g，蒸餾水1 000 mL，在121℃、101 kpa下滅菌15 min。

復(fù)篩液體培養(yǎng)基：NaNO30.500 g，濾紙(用1.000% CH3COOH溶液浸泡)5.000 g，KCl 0.500 g，CaCl 0.005 g，K2HPO41.000 g，CuSO40.050 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.050 g，MgSO40.500 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，在121℃、101 kpa下滅菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 纖維素降解菌的平板初篩

分別稱取樣品各10.000 g，在 90 mL無菌生理鹽水中充分混勻，30℃、120 r/min，搖床培養(yǎng)30 min，吸取1 mL樣品至 9 mL無菌蒸餾水的試管中，稀釋梯度依次為10-2、10-3、10-4，吸取100 μL涂布于剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，放置生化培養(yǎng)箱，30℃，培養(yǎng)2～5 d。待菌生長后，將菌株分別點接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，放置生化培養(yǎng)箱，30℃，培養(yǎng)5 d。用1 M NaCl浸泡30 min，洗脫。測量透明圈直徑，計算酶相對比活力：A=水解圈直徑/天數(shù)。將酶相對比活力較高的菌株轉(zhuǎn)接至NA培養(yǎng)基斜面上，30℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 纖維素酶活力測定

將酶相對比活力較高的菌株制備菌懸液，取 10 mL，12 000 r/min，離心10 min，上清液即為粗酶液。

內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)活力測定[13]：取 2 mL 羧甲基纖維素溶液于 25 mL 刻度試管中，加 0.100 mL 粗酶液，混合均勻，50℃，水浴20 min后，再加入 3 mL DNS 試劑，沸水浴10 min，定容25 mL，在520 nm 下測定其吸光值(A520)。酶活力計算：以每1 min 產(chǎn)生1 μmol 還原糖定義為1 個酶活力單位(U)。對照組為 100℃水浴滅活 5 min 的粗酶液。

濾紙酶(FPA)活力測定[14]：取0.500 mL 粗酶液，加入 2 mL 醋酸緩沖液和1條濾紙(經(jīng)酸處理)于25 mL刻度試管中，50℃ ，水浴1 h后，往試管里加入3 mL DNS試劑，沸水浴10 min，定容25 mL，在520 nm下測定其吸光值(A520)，酶活力計算：以每 1 min 產(chǎn)生 1 μmol 還原糖定義為1個酶活力單位(U)。對照組為100℃水浴滅活5 min的粗酶液。

1.2.3 菌株的分子鑒定

采用美國ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM試劑盒提取菌株基因組。利用通用引物擴增細菌16s rDNA或真菌18s rDNA。PCR擴增反應(yīng)體系為30 μL，含有10 μL premixTaq，上下游引物各0.500 μL，模板1 μL，無菌水12 μL。16s rDNA擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min；18 s rDNA擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物測序由上海生物工程有限公司完成。將得到的測序序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行BLAST分析，用ClustalX 軟件和 MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 菌株復(fù)配

將酶活力最高的菌株M22與提高秸稈發(fā)酵品質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)J1，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同配比液體搖瓶發(fā)酵，30℃，120 r/min，搖床培養(yǎng) 5～7 d后測定酶活力。表1

表1 混菌混合配比試驗設(shè)計
Table 1 The design of mix strain rate

試驗組The experimental groupJ1J2J3M22①1111②2111③1211④1121⑤1112⑥---1

1.2.5 棉秸稈固體發(fā)酵優(yōu)化

以粉碎至長2 cm左右的棉秸稈為底物，進行固體發(fā)酵實驗。以纖維素降解率為指標(biāo)，以初始加水量、接種量、發(fā)酵時間為因素，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件設(shè)計二次回歸中心組合試驗，擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系。響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計。表2

1.2.6 棉稈發(fā)酵飼料化學(xué)成分含量測定含量測定

采用范式( Van Soest) 纖維測定法測定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素含量[15]。纖維素降解率(%)=(原始棉秸稈中纖維素含量/處理后棉秸稈中纖維素含量)×100%

表2 響應(yīng)面實驗因素及水平設(shè)計
Table 2 The design of cotton solid fermentation experiment

因素Factor水平 Level-101初始加水量(%) Initial water addition607080接種量(%) Inoculation amount51015發(fā)酵時間(d) Fermentation time202530

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，確定棉秸稈固體發(fā)酵最優(yōu)試驗條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素高效降解菌株的篩選

2.1.1 纖維素降解菌株的分離篩選

從糞便及土壤樣品中分離出能在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)透明圈的菌株24株。圖1

圖1 部分菌株在剛果紅纖維素瓊脂平板上產(chǎn)生的透明圈
Fig.1 Transparent circle of strains in congo red cellulose agar plate

2.1.2 菌株纖維素酶活力直觀評價結(jié)果

將菌株分別點接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上，利用游標(biāo)卡尺測量透明圈直徑，并計算酶相對比活力：A=水解圈直徑/天數(shù)。得到纖維素降解菌產(chǎn)纖維素酶能力的直觀評價結(jié)果。從透明圈測定結(jié)果中可以看出，透明圈直徑與菌落直徑的比例最大值是6.200，為菌株 M22。表3

表3 纖維素分解菌的分解纖維素能力及產(chǎn)酶能力直觀評價
Table 3 Evaluation of the enzyme producing capacity of the celluloses-degrading microbes

序號The number樣品來源The sample sourceD(mm)d(mm)Dd(mm)A值The value of AM1羊糞2.1211.5211.3920.423M2羊糞9.8021.8825.2131.961M3羊糞8.3022.4833.3511.663M4羊糞3.4811.9821.7600.692M5牛糞8.2442.1613.8141.647M6牛糞2.0621.6241.2720.413M7羊糞7.4212.3803.1211.481M8牛糞6.5841.9623.3611.314M9土壤4.4230.9414.7010.885M10羊糞7.0002.7002.5901.401M11羊糞13.2608.4411.5712.650M12牛糞11.0311.9605.6322.205M13駱駝糞1.9811.2021.6520.393M14堆肥飼料2.8832.2031.3110.572M15駱駝糞2.2421.6841.3320.442M16羊糞3.5002.0611.7030.701M17牛糞2.1011.4221.4840.421M18牛糞2.3221.6611.4010.460M19土壤6.8811.9473.5521.371M20土壤5.4672.3822.2941.090M21土壤9.4082.3214.0521.881M22土壤11.0411.7886.2012.205M23土壤8.3041.9014.3751.666M24駱駝糞0.8800.6851.2910.174

注: d 表示菌株菌落直徑；D 表示水解圈直徑；D/d 表示水解圈直徑與菌落直徑的比值。天數(shù)均為5 d

Note: d: Diameter of the strains colony; D: Diameter of the hydrolytic circle; D / d: Ratio of the hydrolytic circle and the strains colony. The number of days are all 5 d

2.1.3 CMC酶和FPA酶活力的測定

對透明圈直徑較大的10 株菌株進行酶活力測定，在540 nm處。表4

表4 不同含量葡萄糖對應(yīng)的吸光光度值
Table 4 Opticald ensity of the different content glucose

葡萄含量Grape content(mg/mL)020406080100120140OD值The value of OD00.0110.0670.1440.2000.2600.3210.404

繪制出的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

研究表明，回歸直線方程線性公式為y=0.003x-0.033，y為吸光度(OD)值，x為還原性糖濃度(mg/mL)，補償參數(shù)為0.033，R2=0.985 7，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性好，公式成立。根據(jù)方程式中函數(shù)，計算出葡萄糖物質(zhì)量。圖2

不同的菌株之間FPA酶活力有明顯差異，其中酶活力最強的菌株是M22、M12、M2和M10，酶活力分別為9.699、8.447、7.457和7.283 U/h；不同菌株間的CMC酶活力也有明顯的差異，酶活力最強的是M22，其次是M12、M2和M10，分別為10.435、8.876、8.550和8.433 U/h。綜合結(jié)果，篩選出菌株M22做后續(xù)實驗。表5

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2 Glucose standaed carve

表5 菌株FPA、CMC酶活力測定結(jié)果
Table 5 Enzyme activity determination results of strains

菌株編號Strain number濾紙酶活Filter paper activity(U/h)羧甲基酶活(U/h)Carboxymethyl cellulase activity(U/h)M27.4578.550M33.3935.113M55.7815.349M73.9644.744M107.2838.433M128.4478.876M195.5587.228M216.4396.904M229.69910.435M236.8138.100

2.2 降解菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育

根據(jù)菌株篩選及酶活力測定實驗，得到一株細菌。采用ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM試劑盒提取菌株基因組，16S rDNA PCR 擴增產(chǎn)物，測序后，進行相似性分析，發(fā)現(xiàn)序列與 M22 相似性最高的菌株均屬于Bacillus屬, 其中與Bacillussp.cp-24(KY041855)處于最小分支，是Bacillussp. cp-24(KY041855)的近似種，相似性達到 99%，利用MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。菌株 M22的遺傳距離與枯草芽孢桿菌(Bacillusubtilis)遺傳距離最近，可將菌株 M22 定為枯草芽孢桿菌(Bacillusubtilis)。圖3

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 Cladogram of antagonistic strains

2.3 混菌最優(yōu)實驗配比

將酶活力最高的菌株M22與提高秸稈發(fā)酵品質(zhì)的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)J1，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同比例設(shè)計實驗，混合菌液體發(fā)酵實驗結(jié)果。從試驗結(jié)果看出，實驗組③的酶活力最高，此實驗組的混合比例是J1∶J2∶J3∶M22=1∶2∶1∶1，F(xiàn)PA酶活力為 19.420 U/L，CMC酶活力為 20.354 U/L，最終，選出第③實驗組做后續(xù)實驗。表6

表6 混菌混合配比試驗結(jié)果
Table 6 The results of Mixed fungus mix ratio test

實驗組Experience group濾紙酶活Filter paper activity(U/h)羧甲基纖維素鈉酶活Carboxymethyl cellulase activity(U/h)①11.41314.534②15.61616.710③19.42020.354④14.83117.144⑤16.44418.522⑥10.73610.850

2.4 棉秸稈固體發(fā)酵纖維素降解條件優(yōu)化

2.4.1 模型建立

采用3因素3水平響應(yīng)面進行分析，研究初始加水量、接種量、發(fā)酵時間三個因素交互作用以及各因素對纖維素降解率的影響。試驗設(shè)計，各因素水平編碼見表2。經(jīng)Design-Expert.V8.0.6.1軟件對實驗結(jié)果進行回歸統(tǒng)計分析，見表6。根據(jù)表6的試驗結(jié)果，以試維素降解率為Y值為響應(yīng)值，得到如下回歸方程：

Y=18.41+5.47×X1+1.91×X2+4.11×X3+1.16×X1×X2+4.02×X1×X3+0.14X2X3+1.16X12-0.67×X22-0.71X32。決定系數(shù)R2=0.973 8，說明方程擬合度好，表明預(yù)測值能與試驗值具有高度相關(guān)度[16]，可用該方程進行方差分析和顯著性檢驗。方差分析結(jié)果表明“Model Prob>F”等于 0.000 1 遠小于 0.05，說明模型是顯著的。在模型各參數(shù)中，接種量X1、發(fā)酵時間X2、初始含水量X3、二次交互項X1X3對纖維素降解率有極顯著(P<0.01)影響。依據(jù)系數(shù)接種量X1=5.47、發(fā)酵時間X2=1.91、初始含水量X3=4.11，可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為接種量X1> 發(fā)酵時間X2> 初始含水量X3。表7

表6 棉稈纖維素降解率響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
Table 6 The chemical composition content determination result of fermented cotton feed

實驗組Experience groupA:接種量A: Inoculation amount(%)B:發(fā)酵時間B: Fermentation time(d)C:初始含水量C: The initial moisture content(%)纖維素降解率The cellulose degradation rate(%)115307027.420210257018.070310306014.68045256011.98055207012.730610206012.440715258033.79085258013.440910257018.0701010257018.1101110257017.9801215207019.9601310307017.960145307015.5301515256016.2401610208019.1101710257019.840

表7 二次響應(yīng)面回歸模型方差
Table 7 ANOVA of the regression model of quadratic response surface

方差來源Source自由度df平方和Sum of Squares均方Mean SquareF 值F ValuePr>FP-valueModel9483.1353.6828.930.000 1X1-水分 X1-Moisture1239.04239.04128.83<0.000 1X2-接種量 X2- Inoculation Amount129.2629.2615.770.005 4X3-發(fā)酵天數(shù) X3-Fermentation Time1135.38135.3872.96<0.000 1X1X215.435.432.930.130 9X1X3164.7264.7234.880.000 6X2X310.0780.0780.0420.843 0X1215.685.683.060.123 6X2211.871.871.010.349 3X3212.142.141.150.318 3殘差 Residual712.991.86失擬 Lack of Fit310.443.485.460.067 4純粹誤差 Pure Error42.550.64合計 Cor Total16496.12

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

圖形能夠提供一種形象的觀測響應(yīng)值和試驗參數(shù)水平關(guān)系的方法[17]。等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強弱，圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著[18]。通過二元回歸方程做響應(yīng)曲面圖和等高線圖。當(dāng)發(fā)酵時間和接種量處于最佳水平時，發(fā)酵時間和接種量的交互作用，隨著接種量增加，纖維素降解率上升；隨著發(fā)酵時間增加，纖維素降解率有上升趨勢，說明發(fā)酵時間和接種量存在顯著的交互作用，且接種量軸向等高線變化密集，發(fā)酵時間軸向等高線變化相對稀疏，故接種量對響應(yīng)值峰值的影響較發(fā)酵時間影響大；當(dāng)初始含水量和接種量處于最佳水平時，交互作用，隨著初始含水量增加，纖維素降解率平穩(wěn)上升，隨著接種量增加，纖維素降解率逐漸上升，接種量軸向等高線變化密集，初始含水量軸向等高線變化相對稀疏，故發(fā)酵時間對響應(yīng)值峰值的影響較初始含水量影響大；當(dāng)初始含水量和發(fā)酵時間處于最佳水平時，交互作用，隨著發(fā)酵時間和初始含水量增加，纖維素降解率逐漸上升，發(fā)酵時間軸向等高線變化密集，初始含水量軸向等高線變化相對稀疏，故發(fā)酵時間對響應(yīng)值峰值的影響較初始含水量影響大，發(fā)酵時間和初始含水量交互顯著。圖4～6

圖4 接種量和發(fā)酵時間對纖維素降解率影響的響應(yīng)曲面和等高線
Fig.4 Response surface and contour graph of the effects of inoculation amount and fermentation time on degradation rate of cellulose

圖5 初始含水量和接種量對纖維素降解率影響的響應(yīng)曲面和等高線
Fig.5 Response surface and contour graph of the effects of ratio of substrate to water and inoculation amount on degradation rate of cellulose

圖6 初始含水量和發(fā)酵時間對纖維素降解率影響的響應(yīng)曲面和等高線
Fig.6 Response surface and contour graph of the effects of ratio of substrate to water and fermentation time on degradation rate of cellulose

2.4.3 回歸模型的驗證

通過軟件分析，當(dāng)接種量為15.0%，發(fā)酵時間為35.0 d，初始含水量為80.0%時，纖維素降解率有一個預(yù)測最大值為36.240%。采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行試驗驗證，試驗測得纖維素降解率為35.910%，表明預(yù)測值與驗證實驗很接近，說明回歸方程能夠比較真實的反映各個因素對棉秸稈降解率的影響。

3 討 論

3.1 飼料資源短缺是限制我國飼料產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展的瓶頸，利用我國現(xiàn)有資源，開發(fā)新型優(yōu)質(zhì)飼料原料是今后我國飼料研究的重點領(lǐng)域[19]。魏敏等[20]測定出新疆奎屯棉花秸稈中粗蛋白6.50%，說明棉秸稈有成為發(fā)酵飼料的潛力。而秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素三者相互纏繞包裹構(gòu)成了植物細胞壁，它們通過各種化學(xué)鍵連接，成為難降解物質(zhì)[21]。近年來，國內(nèi)外致力于研究利用一些物理、化學(xué)、生物技術(shù)來進行預(yù)處理秸稈，從而達到高效利用的目的[22]。微生物降解木質(zhì)纖維素既是生物質(zhì)資源利用中的關(guān)鍵問題，也是亟需解決的難點[23]。

3.2 從動物糞便及土壤中分離篩選出產(chǎn)生透明圈的菌株，結(jié)合FPA酶活力和CMC酶活力測定。通過形態(tài)特征觀察、生理生化試驗、16S rDNA 對其中活性最強的菌株進行種屬鑒定，為一株枯草芽孢桿菌(Bacillusubtilis)。枯草芽孢桿菌是少量可分泌纖維素胞外酶的細菌之一，是具有木質(zhì)纖維素降解能力較高的菌株[24]，能夠產(chǎn)生包括纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多種酶系，主要通過分泌的纖維素酶的纖維素結(jié)合域附著在木質(zhì)纖維素表面，纖維素受細菌作用易于膨脹而被破壞分解[25]，王堯悅等[26]分離出一株纖維素降解菌經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)該菌株對麩皮的粗纖維有很高的降解率。

3.3 單菌發(fā)酵分解纖維素產(chǎn)生的還原糖除了部分供微生物自身利用外，大部分累積在培養(yǎng)基中，會反饋阻遏微生物酶類的分泌，影響纖維素的降解[27]。采用混菌發(fā)酵可避免產(chǎn)物的阻遏效應(yīng)，混合菌互利共生，在發(fā)酵過程中，添加乳酸菌可提高乳酸、乙酸含量[28]，酵母菌菌體蛋白含量極為豐富，主要被用來利用培養(yǎng)基中的非淀粉多糖作為碳源[29]，使發(fā)酵更為徹底[30]。同單菌發(fā)酵一樣，微生物接種量、發(fā)酵時間、水分含量等因素對混菌發(fā)酵也有重大影響[31]。研究利用響應(yīng)面分析法建立棉秸稈纖維素降解率與初始含水量﹑接種量﹑發(fā)酵天數(shù)三個關(guān)鍵因素之間的二次多項式回歸模型，優(yōu)化了棉秸稈固體發(fā)酵纖維素的工藝條件，為棉秸稈飼料化提供了試驗及理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

4.1 采用剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基，從糞便及土壤等樣品中分離出能夠產(chǎn)生透明圈的菌株24株，根據(jù)水解圈直徑/天數(shù)比值直觀確定酶相對比活力，其中，菌株 M22 透明圈直徑與菌落直徑的比例最大值是6.20，測定FPA酶活力和CMC酶活力，該菌株酶活力最大，分別為9.699 U/h、10.435 U/h，經(jīng)分子鑒定，M22為枯草芽孢桿菌(Bacillusubtilis)，且該菌株符合《飼料添加劑品種目錄(2013)》中微生物添加菌的規(guī)定，可以應(yīng)用到飼料添加當(dāng)中。因此，M22為最適的菌株用作后續(xù)實驗。

4.2 將菌株M22與產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis) J1，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)J2，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)J3，按不同比例設(shè)計，實驗組③在六組實驗中的FPA酶活力和CMC酶活力最高，F(xiàn)PA酶活力為19.420 U/L，CMC酶活力為 20.354 U/L，此實驗組的混合比例為J1∶J2∶J3∶M22=1∶2∶1∶1，另外，六組混菌實驗的酶活力比添加單菌時候酶活力都要高。最終，選出第實驗組③做后續(xù)固體發(fā)酵優(yōu)化實驗。

4.3 采用3因素3水平的響應(yīng)面進行分析，研究初始加水量、接種量、發(fā)酵時間三個因素交互作用以及各因素對纖維素降解率的影響。得出如下回歸方程：Y=18.41+5.47×X1+1.91×X2+4.11×X3+1.16×X1×X2+4.02×X1×X3+0.14X2X3+1.16X12-0.67×X22-0.71X32。方差分析結(jié)果，決定系數(shù)R2=0.973 8，“Model Prob>F”等于 0.000 1 遠小于 0.05，說明模型是顯著。在模型各參數(shù)中，接種量X1、發(fā)酵時間X2、初始含水量X3、二次交互項X1X3對纖維素降解率有極顯著(P<0.01)影響。依據(jù)系數(shù)接種量X1=5.47、發(fā)酵時間X2=1.91、初始含水量X3=4.11，可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為接種量X1> 發(fā)酵時間X2> 初始含水量X3。通過軟件Design-Expert.V8.0.6.1軟件經(jīng)手動優(yōu)化后的回歸方程求解，預(yù)測最佳棉秸稈固體發(fā)酵條件：接種量為15.0 %，發(fā)酵時間為35.0 d，初始含水量為80.0 %，在此條件下，纖維素降解率有一個預(yù)測最大值為36.24%。采用上述最優(yōu)發(fā)酵條件進行試驗驗證，試驗測得纖維素降解率為35.91%。