林標(biāo)聲， 汪麗芳， 張凱麗， 王澤輝， 林占熺，3

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖 364012； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002；3.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002)

生物固氮菌肥近年來(lái)在小麥、玉米、水稻等農(nóng)作物種植中已開(kāi)始被廣泛使用，相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)氮肥，微生物固氮菌肥效率高、污染小，是一種環(huán)境友好型生物肥料，對(duì)改良土壤環(huán)境、提高作物產(chǎn)量均有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[1]。固氮菌肥有僅含固氮菌的單菌株制劑和固氮菌與解磷菌、解鉀菌聯(lián)合的多菌株制劑。相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是單菌株制劑還是多菌株制劑，均對(duì)作物生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但多菌株制劑的施用效果一般要強(qiáng)于單菌株制劑。原因可能是多菌株制劑中不同類(lèi)型的微生物可以互相提供生長(zhǎng)基質(zhì)和養(yǎng)分，如一些固氮菌對(duì)解磷細(xì)菌的解磷作用也十分有利，而一些解磷菌生理代謝物質(zhì)能促進(jìn)固氮菌的生長(zhǎng)[2]。目前所報(bào)道的固氮菌肥多采用聯(lián)合固氮菌，如棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)等，但關(guān)于變棲克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)固氮菌肥的報(bào)道較少[3]。此外，多年來(lái)研究者對(duì)固氮菌、解磷菌混合菌肥的應(yīng)用效果說(shuō)法不一，存在較大爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步探討[4-5]。因此，本研究以從巨菌草中分離得到的主要固氮菌群變棲克雷伯氏菌為固氮菌株，選擇適宜的解磷菌混合培養(yǎng)，研究?jī)烧唛g的相互作用，并據(jù)此制備固氮菌、解磷菌混合菌肥，研究對(duì)作物的促生作用，以期為今后微生物固氮菌肥的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)，使固氮菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)“以氮促磷、以磷增氮”的良好效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與玉米種子

固氮菌：變棲克雷伯氏菌，分離自巨菌草成熟期根部，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。解磷菌：膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillusmucilaginosus)，對(duì)無(wú)機(jī)磷有較強(qiáng)的分解能力，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。玉米種子品種：仲玉988，從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)。菌肥配制原料：巨菌草，選用拔節(jié)期或成熟期的莖、葉部分，粉碎后低溫烘干，過(guò)100目篩；菌草食(藥)用菌菌糟，選用無(wú)木屑，僅用菌草栽培的食(藥)用菌菌糟，低溫烘干、粉碎，過(guò)100目篩；營(yíng)養(yǎng)液，配方為紅糖3～5 g、硫酸鎂0.05～0.15 g、過(guò)磷酸鈣1～2 g、水100 mL。

1.2 培養(yǎng)基

Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基配方：甘露醇10 g/L，KH2PO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.2 g/L，CaSO4·2H2O 0.1 g/L，CaCO35.0 g/L，pH值7.0～7.2；磷細(xì)菌培養(yǎng)的有機(jī)磷培養(yǎng)基配方：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉 0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵 0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，卵磷脂0.2 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，pH值7.0～7.2，固體平板添加瓊脂20 g/L；磷細(xì)菌培養(yǎng)的無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基配方：葡萄糖10 g/L，磷酸鈣5 g/L，硫酸銨 0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂 0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，pH值7.0～7.2，固體平板添加瓊脂20 g/L；固氮菌、接磷細(xì)菌混合培養(yǎng)的無(wú)氮培養(yǎng)基配方：蔗糖7.5 g/L，磷酸二氫鈉2.0 g/L，硫酸鎂 0.5 g/L，氯化鈉0.5 g/L，碳酸鈣0.1 g/L，氯化鐵0.005 g/L，磷灰石2.0 g/L，pH值7.0～7.2；LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 巨菌草內(nèi)生固氮菌變棲克雷伯氏菌解磷能力判定 將變棲克雷伯氏菌在無(wú)氮液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液進(jìn)行梯度稀釋后，分別涂布到有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷固體平板中，測(cè)定變棲克雷伯氏菌單菌落在2種培養(yǎng)基中的溶磷圈直徑(mm)；另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，按1%的量分別接入有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150～180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)定2種培養(yǎng)基中的溶磷量(μg/mL)。分析變棲克雷伯氏菌的解磷能力，并以此為依據(jù)選擇適合的解磷菌混合培養(yǎng)。溶磷量的測(cè)定采用鉬酸銨比色法[6]。

1.3.2 變棲克雷伯氏菌與所選解磷菌的互作研究 (1)單菌培養(yǎng)：將變棲克雷伯氏菌與解磷菌分別接種至無(wú)氮液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150～180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取一定體積的培養(yǎng)液，消煮測(cè)定全氮含量；另取適量培養(yǎng)液于 4 000 r/min 離心8～10 min，取上清，測(cè)其溶磷量；同時(shí)采用稀釋涂平板法分別測(cè)定各培養(yǎng)液中變棲克雷伯氏菌和解磷菌的數(shù)量。全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法[7]，溶磷量的測(cè)定采用鉬酸銨比色法。(2)混合培養(yǎng)：將純培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的變棲克雷伯氏菌與解磷菌菌懸液分別按體積比1 ∶0.5、1 ∶1、0.5 ∶1 3種比例接種到100 mL無(wú)氮液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)瓶容量250 mL)，于 30 ℃、150～180 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按純培養(yǎng)方法計(jì)算全氮含量、溶磷量和菌體數(shù)量，選擇最優(yōu)比例用以制備混合菌肥。

1.3.3 變棲克雷伯氏菌單菌菌肥和混合菌肥的制備 為了提高變棲克雷伯氏菌的存活率，本試驗(yàn)采用巨菌草作為載體制備固氮菌肥，菌肥菌株的分離和載體均來(lái)自同一物質(zhì)。將活化后的變棲克雷伯氏菌和上述試驗(yàn)選擇的最優(yōu)比例的混合菌液分別接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)瓶容量250 mL)，于30 ℃、150～180 r/min下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分別取150～200 mL菌液和650～750 g巨菌草、250～350 g菌草食(藥)用菌菌糟和100～150 mL營(yíng)養(yǎng)液混合裝入帶呼吸閥的聚乙烯薄膜發(fā)酵袋中，在25～32 ℃下發(fā)酵5～10 d，若發(fā)酵物料明顯變軟、顏色變深，則發(fā)酵結(jié)束，按NY 411—2000《固氮菌肥料》檢測(cè)制備的單菌株制劑和多菌株制劑[8]。

1.3.4 變棲克雷伯氏菌單菌和混合菌肥的肥效試驗(yàn) 將所制備的變棲克雷伯氏菌單菌株和多菌株制劑分別進(jìn)行玉米盆栽的肥效試驗(yàn)。共分為4組，分別為對(duì)照組1(僅為普通泥土)、對(duì)照組2(普通泥土加同等比例的菌草、菌糟，不含混合菌液)、試驗(yàn)組1(普通泥土加5%固氮菌單菌株制劑)、試驗(yàn)組2(普通泥土加5%多菌株制劑)。挑選剛冒牙尖、大小基本一致的玉米種子，播種于塑料杯中，每杯播種1粒，每組播種20杯，培養(yǎng)10～15 d，統(tǒng)計(jì)各組玉米出苗的時(shí)間、出苗率、根長(zhǎng)和株高，對(duì)比2種菌肥肥效[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 變棲克雷伯氏菌解磷能力的測(cè)定

如表1所示，變棲克雷伯氏菌在有機(jī)磷培養(yǎng)基中的溶磷圈直徑和溶磷量均明顯高于無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基，表明變棲克雷伯氏菌具有較強(qiáng)的降解有機(jī)磷的能力，但其降解無(wú)機(jī)磷的能力較弱。因此，選擇筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的對(duì)無(wú)機(jī)磷具有較強(qiáng)降解能力的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合培養(yǎng)，以彌補(bǔ)變棲克雷伯氏菌無(wú)機(jī)磷解磷能力的不足。由表1還可以看出，膠質(zhì)芽孢桿菌不僅具有較強(qiáng)的降解無(wú)機(jī)磷的能力，還具有一定降解有機(jī)磷的能力。

表1 變棲克雷伯氏菌解磷能力測(cè)定結(jié)果

2.2 變棲克雷伯氏菌與膠質(zhì)芽孢桿菌的互作研究

由表2可知，未接種的無(wú)氮培養(yǎng)基對(duì)磷有一定的溶解作用；在變棲克雷伯氏菌純培養(yǎng)體系中，氮含量增加，溶磷量減少，表明變棲克雷伯氏菌具有固氮能力，但解磷能力較差；在膠質(zhì)芽孢桿菌純培養(yǎng)體系中，溶磷量增加，同時(shí)產(chǎn)生了少量氮，表明膠質(zhì)芽孢桿菌解磷能力較強(qiáng)，也具有一定的固氮能力。與變棲克雷伯氏菌和膠質(zhì)芽孢桿菌純培養(yǎng)體系相比，2種菌按不同比例接種的混合培養(yǎng)體系的全氮含量和固氮菌數(shù)均有不同程度的增長(zhǎng)，而溶磷量和解磷菌數(shù)有一定的下降。結(jié)果表明，在混合培養(yǎng)體系中，膠質(zhì)芽孢桿菌可能分泌了某種代謝產(chǎn)物對(duì)變棲克雷伯氏菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，使固氮菌數(shù)量增多，全氮含量增加；而變棲克雷伯氏菌的代謝產(chǎn)物可能對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌有一定抑制作用，加上混合培養(yǎng)體系中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)造成了膠質(zhì)芽孢桿菌數(shù)量減少，溶磷量也隨之減少。此外，變棲克雷伯氏菌和膠質(zhì)芽孢桿菌的大量生長(zhǎng)，需要利用部分可溶性磷來(lái)構(gòu)建細(xì)胞成分，這也造成膠質(zhì)芽孢桿菌數(shù)量降低。2種菌不同比例的接種試驗(yàn)表明，當(dāng)變棲克雷伯氏菌和膠質(zhì)芽孢桿菌接種比例為1 ∶1時(shí)，體系中固氮菌數(shù)和全氮含量最高，在此比例下，體系中解磷菌數(shù)量和溶磷量較高，因此綜合分析后，選擇變棲克雷伯氏菌與膠質(zhì)芽孢桿菌最優(yōu)接種比例為1 ∶1。

表2 變棲克雷伯氏菌與膠質(zhì)芽孢桿菌的相互作用

2.3 變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑的性能測(cè)定

表3結(jié)果表明：變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑各性能指標(biāo)均符合NY 411—2000《固氮菌肥料》。但多菌株制劑有效活菌數(shù)更多、雜菌率更低、有機(jī)質(zhì)含量更高、保存有效期更長(zhǎng)，這可能是由于多菌株制劑含有膠質(zhì)芽孢桿菌，其生長(zhǎng)速度更快，使總有效活菌數(shù)更高，有機(jī)質(zhì)含量增加，其他雜菌更不易生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)了保質(zhì)期。

表3 所制備的菌肥與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的比較

注：細(xì)度指過(guò)孔徑為0.18 mm標(biāo)準(zhǔn)篩的篩余物所占比例。

2.4 變棲克雷伯氏菌單菌株制劑和多菌株制劑的肥效試驗(yàn)

表4結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，2種菌肥對(duì)玉米均有一定的促生效果，但多菌株制劑組(試驗(yàn)組2)的促生效果明顯優(yōu)于單菌株制劑組(試驗(yàn)組1)，其出苗時(shí)間減少了8.93%，出苗率、根長(zhǎng)增量、株高增量分別提高了11.11%、16.92%、28.77%。多菌株制劑中解磷菌的添加對(duì)作物的生長(zhǎng)起到了一定促生作用，這可能是由于解磷菌的添加有利于固氮菌生長(zhǎng)和增加全氮含量，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)，這與“2.2”節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果一致。

表4 所制備的單菌株和多菌株制劑對(duì)玉米的促生試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

變棲克雷伯氏菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，是根系聯(lián)合固氮微生物的一種[10]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)，變棲克雷伯氏菌在巨菌草中豐度最高、含量最為豐富，為最主要的內(nèi)生固氮菌群，并已在巨菌草成熟期的根部分離得到。變棲克雷伯氏菌具有較強(qiáng)的固氮作用，同時(shí)也具有一定的降解有機(jī)磷、分泌吲哚乙酸(IAA)和產(chǎn)鐵載體的能力，是固氮菌肥開(kāi)發(fā)的優(yōu)良種質(zhì)資源[11]。但近年來(lái)，實(shí)踐證明單菌株制劑的固氮菌菌肥易失活、保質(zhì)期短，其生產(chǎn)施用受到了一定限制[12]。因此，本試驗(yàn)研究了變棲克雷伯氏菌與對(duì)無(wú)機(jī)磷有較強(qiáng)降解能力的膠質(zhì)芽孢桿菌的相互作用，以期能提高變棲克雷伯氏菌固氮菌肥的總菌數(shù)，增加有效活菌數(shù)，延長(zhǎng)有效期。試驗(yàn)結(jié)果表明，與2種菌純培養(yǎng)體系相比，混合培養(yǎng)時(shí)體系中全氮含量和固氮菌數(shù)均有不同程度的增長(zhǎng)，而溶磷量和解磷菌數(shù)有一定的下降；當(dāng)2種菌按1 ∶1比例接種時(shí)，混合培養(yǎng)的協(xié)同作用最好。試驗(yàn)所制備的多菌株制劑符合行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其有效活菌數(shù)、有效期和對(duì)玉米盆栽的促生性能均優(yōu)于單菌株制劑，具有更好的應(yīng)用前景。

固定菌和解磷菌是微生物菌肥中常添加的2種微生物菌劑，研究表明，多菌株的混合培養(yǎng)有利于互相提供營(yíng)養(yǎng)，消除不利因素，發(fā)揮有益的代謝協(xié)同作用[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在固氮菌肥中添加解磷菌可以促進(jìn)固氮菌生長(zhǎng)，提高體系中的全氮含量，有利于作物生長(zhǎng)，證實(shí)了多菌株制劑的促生效果確實(shí)優(yōu)于單菌株制劑，多菌株復(fù)合菌肥的技術(shù)值得深入探討和推廣應(yīng)用[14]。