李磊，楊丹，亓守冰，左然濤，王姮，丁君，常亞青

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧 大連 116023； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 210095)

中間球海膽Strongylocentrotusintermedius又稱蝦夷馬糞海膽，主要分布于日本北海道和俄羅斯遠(yuǎn)東海域[1]，由于其性腺色澤好、品質(zhì)佳，在國內(nèi)外市場頗受歡迎，是可食用海膽中經(jīng)濟(jì)價值最高的種類之一。中間球海膽自1989年由大連海洋大學(xué)從日本引入中國后，隨著人工育苗、中間育成等技術(shù)的研發(fā)成功，現(xiàn)已成為中國最重要的海膽?zhàn)B殖種類，在遼寧、山東等省沿海地區(qū)的養(yǎng)殖已經(jīng)初具規(guī)模，2017年中國海膽?zhàn)B殖年產(chǎn)量已達(dá)10 054 t[2-3]。性腺作為海膽唯一可食用的部分，其品質(zhì)好壞直接決定了海膽的經(jīng)濟(jì)價值和繁殖能力[4]，性腺中的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和糖類等對海膽生長和生殖至關(guān)重要[5-7]。

在水產(chǎn)動物性腺發(fā)育過程中，總脂、甘油三酯、磷脂、不飽和脂肪酸的正常積累對性腺發(fā)育、胚胎發(fā)育和早期幼體的成長極為關(guān)鍵[8-9]。研究水產(chǎn)動物繁殖前后組織中脂類和脂肪酸組成的變化，有助于認(rèn)識水產(chǎn)動物性腺發(fā)育期的脂類營養(yǎng)需求，從而為水產(chǎn)動物親本的脂類營養(yǎng)強(qiáng)化提供理論依據(jù)和實踐參考。近年來的相關(guān)研究中，吳旭干等[10]比較了瘤背石磺Onchidiumstruma產(chǎn)卵前后脂類和脂肪酸組成的變化，應(yīng)雪萍等[11]比較了中華絨螯蟹Eriocheirsinensis成熟蟹、抱卵蟹、流產(chǎn)蟹肝胰腺脂肪酸的組成，湯辰婧等[12]對不同階段中華絨螯蟹脂類含量及脂肪酸組成進(jìn)行了分析，Shirai等[13]對日本鯰Silurusasotus在產(chǎn)卵前后卵巢中脂肪和脂肪酸組成進(jìn)行了研究。

目前，有關(guān)人工飼料對海膽性腺脂類及脂肪酸組成影響的研究已有一些報道[14-18]，研究表明，海膽性腺脂肪酸累積會跟其他動物一樣受到飼料脂肪酸組成的影響。但是，對中間球海膽繁殖營養(yǎng)方面的研究較少，特別是有關(guān)海膽排精/卵前后性腺中脂類及脂肪酸含量變化的研究尚未見報道。本研究中，測定和比較了中間球海膽繁殖前后性腺中脂類和脂肪酸組成的變化，以期為海膽親本營養(yǎng)繁殖學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用海膽為大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室培育的2齡健康中間球海膽(殼徑

為(56.69 ±1.56)mm，殼高為(31.30 ±1.87) mm，體質(zhì)量為(54.27 ±3.71 g)，試驗前將30枚隨機(jī)取樣的個體暫養(yǎng)于實驗室水槽(水溫為18.0 ℃±1.3 ℃)，暫養(yǎng)期間(7月)飽食投喂海帶，每天吸底并全量換水1次。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 試驗開始時，將30枚備用海膽隨機(jī)編號后分別用游標(biāo)卡尺(Mahr16ER)和電子天平(G&GJJ100)測量其殼徑(mm)、殼高(mm)和體質(zhì)量(g)。排精/卵前后分別取樣。

(1) 7月對中間球海膽隨機(jī)進(jìn)行解剖，取性腺組織，在顯微鏡下辨別雌、雄后，分別取3枚雌性、3枚雄性個體的性腺，用電子天平稱量后，將所有性腺組織在液氮中快速冷凍6 h后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 隨機(jī)選取中間球海膽注射1 mL 0.5 mol/L KCl，分別用干凈培養(yǎng)皿和裝有過濾海水的塑料瓶收集3枚雄性和雌性個體的精卵，待海膽精子和卵完全排出后，將雌、雄個體分別養(yǎng)殖在不同的籠內(nèi)，暫養(yǎng)7 d后(暫養(yǎng)期間飽食投喂)對海膽進(jìn)行解剖，取每個個體的性腺組織，稱重后在液氮中快速冷凍6 h后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆?。性腺指?shù)(GI，%)計算公式為

GI=WG/WB×100%。

其中：WG為性腺的總濕質(zhì)量(g)；WB為海膽的體質(zhì)量(g)。

取部分產(chǎn)卵前和產(chǎn)卵后雌、雄個體的性腺稱重后，放入預(yù)先稱重的干凈培養(yǎng)皿中，72 ℃烘箱中烘干72 h至恒重，再次稱重，計算性腺含水率。含水率(GM，%)計算公式為

GM=(WG1-WD1)/WG1×100%。

其中：WG1為部分性腺的濕質(zhì)量(g)；WD1為部分性腺烘干后的質(zhì)量(g)。

1.2.2 脂類組成測定

總脂提?。翰捎脟H通用的標(biāo)準(zhǔn)脂肪提取法,即氯仿-甲醇(體積比為2∶1)法[19]。

磷脂含量測定：將總脂用硝酸-高氯酸混合液(體積比為4∶1)消化，并用鉬藍(lán)比色法測定總脂中的磷脂含量[20]。

膽固醇和甘油三酯含量測定：將所提總脂用氯仿溶解并定容至100 mL，取一定體積的氯仿溶液，減壓干燥后，按照試劑盒的使用說明測定膽固醇和甘油三酯含量。

游離脂肪酸含量測定：取上述氯仿溶液，減壓干燥后，用4 mL正庚烷溶解，并加入1 mL脂肪酸顯色劑 (5%醋酸銅溶液，用吡啶調(diào)節(jié)pH為6.1)，充分振蕩后離心，取上層有機(jī)相于710 nm波長下測定吸光度，計算游離脂肪酸含量。該部分由青島科標(biāo)有限公司檢測。

1.2.3 脂肪酸組成測定 采用毛細(xì)管氣相色譜法測定脂肪酸含量。用ThermoFisher Trace 1310 ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進(jìn)行分析，由青島科標(biāo)公司檢測。

(1) 樣品處理。取80～100 mg樣品加入到15 mL離心管中，繼續(xù)加入2 mL 5%鹽酸-甲醇溶液，3 mL氯仿-甲醇溶液(體積比為1∶1),100 μL十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)。于85 ℃水浴鍋中水浴1 h，水浴完成后，等溫度降到室溫，在離心管中加入1 mL正己烷，震蕩萃取2 min之后靜置1 h，等待分層。取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL。再用0.45 μm濾膜過膜后上機(jī)測試。

(2) 色譜條件。TG-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，不分流進(jìn)樣，開閥時間為1 min，載氣流速為1.2 mL/min。進(jìn)樣口溫度為290 ℃，檢測器溫度為80 ℃，保持1 min后以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，繼續(xù)以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃，最后以2 ℃/min的速率升到270 ℃，保持3 min。

(3) 質(zhì)譜條件。傳輸線溫度為280 ℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30～400 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 SPSS 18.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗進(jìn)行顯著性差異檢測，顯著性水平設(shè)為0.05，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 繁殖前后中間球海膽性腺指數(shù)、含水率、脂肪含量和脂類成分的變化

從表1 可見：中間球海膽排卵/精前與排卵/精后，雌、雄個體間的性腺指數(shù)和性腺含水率均無顯著性差異(P>0.05)，排卵前雌性個體性腺中脂類含量顯著高于排精前雄性個體(P<0.05)，排卵后雌性個體性腺中脂類含量顯著高于排精后雄性個體(P<0.05)；中間球海膽雌、雄個體繁殖后，性腺指數(shù)、脂類含量較繁殖前顯著降低(P<0.05)，性腺含水率在繁殖前后無顯著性差異(P>0.05)。

表1 中間球海膽繁殖前后性腺指數(shù)、含水率和脂類含量的變化

注：同列中，*表示繁殖前后個體間有顯著性差異(P<0.05)；a表示排精前與排卵前雌、雄個體間有顯著性差異(P<0.05)；b表示排精后與排卵后雌、雄個體間有顯著性差異(P<0.05);脂類含量=性腺總脂含量/性腺濕質(zhì)量，下同

Notes: * indicates significantly different between pre- and post spawning in the same column(P<0.05)，a indicates significant difference between males and females before pre spawning；b indicates significant difference between males and females post spawning； gonad lipid content is the ratio of total lipid to gonad wet weight,et sequentia

中間球海膽性腺脂類主要由磷脂、膽固醇、游離脂肪酸和甘油三酯組成, 表2為各性腺中脂類成分的含量(g/100 g,脂類成分含量/性腺濕質(zhì)量)。從表2可見：海膽性腺以磷脂為主；雌、雄海膽中，排精前雄性個體性腺中的磷脂含量和游離脂肪酸含量顯著高于排卵前雌性個體(P<0.05)，而排精前雄性個體性腺中的膽固醇含量則顯著低于排卵前雌性個體(P<0.05)，甘油三酯在兩者間無顯著性差異(P>0.05)；排精后雄性個體性腺中的膽固醇含量顯著低于排卵后雌性個體膽固醇含量(P<0.05)，在其他3種脂肪組成上排精后與排卵后雌、雄個體間不存在顯著性差異(P>0.05)；雌性個體性腺中的磷脂含量在排卵前后無顯著性差異(P>0.05)，膽固醇含量在雌性個體排卵后顯著升高(P<0.05),游離脂肪酸和甘油三酯在雌性個體產(chǎn)卵后顯著降低(P<0.05)；雄性個體排精前后性腺中的磷脂含量無顯著性差異(P>0.05)，雄性個體在排精后性腺中的膽固醇、游離脂肪酸和甘油三酯含量均顯著降低(P<0.05)。

表2 中間球海膽繁殖前后性腺中脂類成分含量

2.2 繁殖前后中間球海膽性腺脂肪酸含量的變化

中間球海膽繁殖前后性腺脂肪酸組成(mg/kg,脂肪酸成分含量/性腺濕質(zhì)量)如表3所示。從表3可見：通過毛細(xì)管氣相色譜法，共檢測出24種脂肪酸，雌、雄個體性腺的主要脂肪酸(脂肪酸含量>1400 mg/kg)為C14∶0、C16∶0(軟脂酸)濕質(zhì)量、C18∶0(硬脂酸)、C20∶1、C20∶4(n-6)(AA)、C20∶5(n-3)(EPA)。排精前與排卵前，雌性個體性腺中的C13∶0、C14∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C16∶1、C20∶2、C20∶4(n-6)(AA)、∑SFAs、∑PUFAs、∑n-6PUFAs含量顯著低于雄性個體(P<0.05)，雌性個體在C18∶1(n-9)、C18∶2(n-6)、∑MUFAs含量上顯著高于雄性個體(P<0.05)，雌、雄個體在C15∶0、C16∶0、C14∶1、C20∶1、C18∶3(n-6)、C22∶1(n-9)、C20∶5(n-3)(EPA)、∑n-3PUFAs含量上無顯著性差異(P>0.05)。

排精后與排卵后，雄性性腺中的 C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C16∶1、C18∶1(n-9)、C20∶1、C22∶1(n-9)、C18∶2(n-6)、C18∶3(n-6)、C20∶2、C20∶3(n-3)、∑SFAs、∑MUFAs、∑PUFAs、∑n-6PUFAs含量顯著高于雌性個體(P<0.05)，雌性個體性腺中的C18∶0、C20∶5(n-3)和C22∶6(n-3)含量顯著高于雄性個體(P<0.05)，雌、雄個體在C20∶0、C20∶4(n-6)(AA)、∑n-3PUFAs含量上無顯著性差異(P>0.05)。

在排/精卵前中間球海膽性腺中大部分脂肪酸含量高于排精/卵后，其性腺組織中C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C20∶0、C16∶1、C20∶1、C22∶1(n-9)、C18∶2(n-6)、C18∶3(n-6)、C20∶2、C20∶4(n-6)(AA)、C20∶5(n-3)(EPA)、∑SFAs、∑PUFAs、∑n-3PUFAs、∑n-6PUFAs的含量在繁殖前均顯著高于繁殖后(P<0.05)。雌性海膽排卵后性腺中C18∶1(n-9)、∑MUFAs含量顯著低于排卵前(P<0.05)，而C18∶0的含量在海膽產(chǎn)卵后顯著升高(P<0.05)；雄性海膽排精后性腺中C13∶0、C18∶0含量顯著低于排精前 (P<0.05)，C14∶1含量在排精前后無顯著性差異(P>0.05)，雄性海膽在排精后只有C18∶1(n-9)和∑MUFAs含量顯著升高(P<0.05)。在產(chǎn)后的雌、雄海膽性腺中均檢測到微量的C22∶6(n-3)(DHA)和C20∶3(n-3)。

表3 中間球海膽繁殖前后性腺中脂肪酸組成(濕質(zhì)量)

注：同行中*表示繁殖前后個體間有顯著性差異(P<0.05)；a表示排精前與排卵前雌、雄個體間有顯著性差異(P<0.05)；b表示排精后與排卵后雌、雄個體間有顯著性差異(P<0.05)；SFAs為飽和脂肪酸總量；MUFAs為單不飽和脂肪酸總量；PUFAs為多不飽和脂肪酸總量； —表示未檢出

Note: *indicates significantly different between pre-and post spawning in the same column (P<0.05)；a indicates significant difference between males and females before pre spawning(P<0.05)；b indicates significant difference between males and females post spawning(P<0.05); SFAs, sum of saturated fatty acids; MUFAs, sum of monounsaturated fatty acids; PUFAs, sum of polyunsaturated fatty acids; —, undetected

3 討論

3.1 繁殖對海膽性腺指數(shù)、含水率、脂類含量的影響

性腺是海膽唯一可食用的部分，性腺品質(zhì)的好壞直接決定其營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，而性腺指數(shù)、脂肪含量和含水率是影響性腺品質(zhì)的重要因素。本研究中發(fā)現(xiàn)，排精前雄性海膽的性腺指數(shù)(GI)略高于雌性海膽，這與孔泳滔等[21]對中間球海膽的研究結(jié)果相同，該研究發(fā)現(xiàn)，3月—10月雄性海膽性腺指數(shù)略高于雌性，這說明雄性海膽性腺發(fā)育速率快于雌性海膽。在繁殖季節(jié)，雄性海參往往先于雌性海參成熟，排精后再刺激雌性個體排卵。本研究中還發(fā)現(xiàn)，排卵/精前，雌性個體的脂類含量普遍顯著高于雄性，這與沈妍等[22]在對F3代中間球海膽家系研究中得到的結(jié)果相似。與海膽相似，中華絨螯蟹也主要以性腺作為重要食用部位，研究發(fā)現(xiàn)，雌性性腺中的脂類含量高于雄性[23]，這可能與雌性海膽繁殖前在卵黃中積累較多卵黃蛋白有關(guān)，卵黃蛋白是一種脂類含量較高的脂蛋白，是幼體發(fā)育過程中重要的營養(yǎng)和能量來源，其含量高低是評價卵質(zhì)量的重要指標(biāo)。與其他動物不同，雌、雄海膽性腺中均含有較高含量的卵黃蛋白，可達(dá)到總蛋白的10%～15%[3]。因此，海膽精/卵的排出導(dǎo)致海膽的性腺指數(shù)及脂類含量出現(xiàn)顯著下降。本研究中還發(fā)現(xiàn)，雌、雄海膽性腺中的含水率無顯著性差異，這與沈研等[24]的研究結(jié)果相同。而常亞青等[25]研究發(fā)現(xiàn)，雌性性腺水分顯著低于雄性，這可能是由于取樣時間不同所致。

3.2 繁殖對海膽性腺脂類成分含量的影響

甘油三酯和磷脂是生物生殖腺的主要脂類組分，并為其后代胚胎發(fā)育和開口前的幼體發(fā)育提供能量，研究表明，甘油三酯是巨扇貝Placopectenmagellanicus[26]、大海扇貝Pectenmaximus[27]和中華絨螯蟹[28]卵巢和胚胎中的主要脂類成分。本研究顯示，中間球海膽性腺中脂類主要為磷脂、膽固醇、游離脂肪酸和甘油三酯，其中，磷脂是主要組成成分，繁殖前后海膽性腺中磷脂含量無顯著性變化。這與對瘤背石磺OnchidiumverruculatumCuvier[10]和桃紅對蝦Penaeusduorarumduorarum[29]的研究結(jié)果不一致，該研究中發(fā)現(xiàn)，瘤背石磺繁殖后性腺中的磷脂下降了80.53%。本研究中，中間球海膽性腺中甘油三酯和游離脂肪酸在排精/卵后含量顯著降低，這說明產(chǎn)卵后脂類水平的降低主要是甘油三酯和游離脂肪酸類。吳旭干等[10]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)卵后雌性瘤背石磺中的游離脂肪酸含量較產(chǎn)卵前顯著升高，這可能是由于產(chǎn)精/卵后脂類合成代謝旺盛，以用于卵黃物質(zhì)的累積，從而為下一個性腺發(fā)育周期做準(zhǔn)備。本研究中，中間球海膽雌性性腺中膽固醇含量在產(chǎn)卵后顯著升高，這一方面可能是中間球海膽在產(chǎn)卵過程中選擇性利用脂類所致，另一方面，膽固醇是雌二醇等性類固醇激素的重要前體物質(zhì)，性類固醇激素含量增加是促進(jìn)性腺進(jìn)入下一發(fā)育周期的重要物質(zhì)。

通過對海膽繁殖前后脂類成分及含量變化的研究，建議在實際生產(chǎn)中海膽繁殖前1～2個月在飼料中添加磷脂、游離脂肪酸、甘油三酯等物質(zhì)，以促進(jìn)海膽性腺發(fā)育，提高海膽的營養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價值。

3.3 繁殖對海膽性腺脂肪酸含量的影響

本研究結(jié)果顯示，中間球海膽雌、雄性腺中共有24種脂肪酸，且排精/卵前后性腺中的脂肪酸種類未發(fā)生變化，其主要飽和脂肪酸包括 C14∶0、C16∶0、C18∶0，不飽和脂肪酸包括C20∶1、C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3)。丁君等[16]研究4種海膽(光棘球海膽Strongylocentrotusnudus、馬糞海膽Hemicentrotuspulcherrimus、海刺猬Glyptocidariscrenularis、中間球海膽)性腺脂肪酸組成時發(fā)現(xiàn)：馬糞海膽性腺中主要不飽和脂肪酸是C20∶1、C16∶1、C20∶2、C20∶4n-6、C20∶5(n-3)，其中C20∶2含量最高；海刺猬性腺中主要不飽和脂肪酸是C20∶1、C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3)，其中C20∶5(n-3)含量最高；光棘球海膽性腺中主要不飽和脂肪酸是C20∶2、C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3)，其中C20∶5(n-3)含量最高；中間海膽中主要不飽和脂肪酸是C20∶1、C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3)，其中C20∶4(n-6)含量最高。這與本研究結(jié)果相似。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，C20∶4(n-6)(AA)和C20∶5(n-3)(EPA)是中國北方4種經(jīng)濟(jì)海膽不飽和脂肪酸的主要組成成分，但這4種海膽性腺中其他種脂肪酸的組成和含量仍存在差異。

中間球海膽排精/卵前，雄性性腺中的C20∶4(n-6)(AA)含量要顯著高于雌性海膽，而EPA含量則無顯著性差異，這與常亞青等[25]的研究結(jié)果一致。排精/卵后，雌、雄海膽大部分脂肪酸含量顯著下降，但C18∶0含量在雌性海膽產(chǎn)卵后顯著升高，C18∶1(n-9)含量在雄海膽性排精后顯著升高，同時，雄性海膽性腺中幾乎所有C18到C20的不飽和脂肪酸含量均顯著高于雌性性腺中相應(yīng)的不飽和脂肪酸含量。而以往有研究表明，貝類產(chǎn)卵后部分脂肪酸含量會有升高現(xiàn)象[10]，同時，也有研究表明，棘皮動物可利用C18單不飽和脂肪酸合成其他的長鏈不飽和脂肪酸(EPA、AA、DHA等)[30-31]，推測中間球海膽繁殖后，性腺中脂肪酸會發(fā)生轉(zhuǎn)化，且在這一過程中雄性海膽較雌性海膽有更快地脂肪酸轉(zhuǎn)化、合成能力，下一步工作中，筆者將重點開展此方面的研究。

4 結(jié)論

采用毛細(xì)管氣相色譜法對中間球海膽繁殖前后性腺中脂類和脂肪酸含量變化進(jìn)行分析比較，結(jié)果如下：

(1)中間球海膽在排精前與排卵前，雌、雄個體間性腺指數(shù)、性腺含水率均無顯著性差異(P>0.05)，雌性性腺中脂類含量顯著高于雄性(P<0.05)。

(2)磷脂是海膽性腺脂類的主要組分，海膽在繁殖后性腺中的游離脂肪酸和甘油三酯顯著下降(P<0.05)，雌性海膽排卵后膽固醇含量顯著升高(P<0.05)。

(3)中間球海膽主要的飽和脂肪酸為C14∶0、C16∶0、C18∶0,不飽和脂肪酸為C20∶4(n-6)、C20∶5(n-3)，雌、雄海膽性腺的大部分脂肪酸含量在排卵/精后顯著下降(P<0.05)，雌性海膽排卵后性腺中的C18∶0含量顯著升高(P<0.05)，雄性海膽排精后性腺中的C18∶1(n-9)含量顯著升高(P<0.05)。