呂 寧，周光海，陳 云，石 磊，李全勝，張國麗

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆石河子大學(xué)，經(jīng)濟與管理學(xué)院，新疆石河子 832003；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，農(nóng)田水利與土壤肥料研究所，新疆石河子 832000；4.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，新疆石河子 832000)

新疆是中國最大的適宜種植棉花的區(qū)域。據(jù)統(tǒng)計，新疆棉花總產(chǎn)量占全國的33%[1]。棉花是新疆的重要經(jīng)濟作物，棉花產(chǎn)值占全疆農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的45%，棉花產(chǎn)業(yè)在新疆的經(jīng)濟生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位[2-3]。但是由于連年種植、不合理的施用化肥，以及高密度覆膜栽培等，新疆棉區(qū)黃萎病害日趨嚴重。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年由于“兩萎”病害造成的經(jīng)濟損失達到15%左右[4]，成為當(dāng)前制約新疆棉花可持續(xù)生產(chǎn)的主要障礙因素。

長期以來棉花黃萎病防治主要依賴化學(xué)藥劑，大量使用化學(xué)殺菌劑帶來嚴重的環(huán)境污染和藥品殘留問題[5-6]。生物農(nóng)藥是利用有益微生物活體或微生物代謝產(chǎn)物進行植病防治的一類藥劑，主要包括拮抗微生物菌劑、植物源農(nóng)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑、抗生素農(nóng)藥等[7-8]，具有易降解、生態(tài)安全、改善土壤環(huán)境等優(yōu)點，因此成為植病防治中的新途徑。有關(guān)棉花黃萎病的生物防治，目前集中在功能菌生防因子的篩選、作用機理及生物制劑的研究開發(fā)[9-13]方面，施藥方式主要是噴施、拌種和灌根[14]。棉花黃萎病是典型的土傳病害，利用滴灌管道可將藥劑直接隨水施入棉花根部，實現(xiàn)藥劑的可控、均勻和靶向施入，對土壤病原菌起到更為直接的抑制作用[15-16]。新疆地區(qū)90%以上棉田均采用滴灌模式[17]，開展隨水施藥技術(shù)研究十分必要。一些植保學(xué)者陸續(xù)開展生物菌劑隨水滴施防治棉花黃萎病的藥效試驗[18-22]，婁善偉等[19]提出每公頃滴施枯草芽胞桿菌9 kg防效顯著提高，劉政等[20]研究發(fā)現(xiàn)每公頃滴施木霉菌厚垣孢子制劑60 kg，對棉花黃萎病防效可達到57.81%。不同的植棉區(qū)，因氣候因素、土壤理化性質(zhì)及種植品種的不同，不同的生物藥劑的施用量存在顯著差異。已有報道中在滴施用量、滴施時間方面缺乏梯度設(shè)計，因此尚未有一致性結(jié)論；另外，生物藥劑滴施后必然會引起土壤微生物菌群變化，但具體的影響效應(yīng)尚不明確。

本研究設(shè)置施藥量梯度試驗，于2015-2016年開展3種不同生物藥劑隨水滴施防治棉花黃萎病的試驗研究，通過調(diào)查各生育期棉花生長性狀，統(tǒng)計棉田黃萎病發(fā)病率和防效，測定分析施藥后土壤微生物數(shù)量變化，明確3種生物藥劑合理的滴施用量，旨在為科學(xué)使用生物藥劑和滴灌施藥技術(shù)防治棉花黃萎病提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

2016年，試驗地點設(shè)在新疆農(nóng)墾科學(xué)院3輪5號試驗地。該試驗地連續(xù)種植棉花5 a，屬黃萎病發(fā)病中等偏重地塊。土壤類型、質(zhì)地及主要理化性狀見表1。

表1 試驗點基本情況Table 1 Physical and chemical properties of tested soils

1.2 供試材料

1.2.1 供試藥劑 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(Bacillussubtilisagent，由河北農(nóng)科院提供，功能菌為枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌，10億個活芽孢菌/g)；“施倍健”哈茨木霉菌劑(Trichodermahumatumagent，主要菌種：木霉菌，哈氏木霉厚垣孢子≥2.0億/g，海南金雨豐生物工程有限公司生產(chǎn))；渝峰“99植?！?重慶市聯(lián)普農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司生產(chǎn)，主要成分：銅、鐵、鋅、錳、硼、鉬等微量元素，以及氨基酸和有機活性物質(zhì))。

1.2.2 供試棉花品種 ‘新陸早60’，由新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所選育。該品種具有早熟、豐產(chǎn)及抗逆性較好等特點。

1.3 試驗設(shè)計

田間試驗采取裂區(qū)設(shè)計。設(shè)置4個主處理(3種藥劑+清水對照)，每種藥劑的3個施藥量為副處理，重復(fù)3次，隨機排列。主區(qū)面積為667 m2，副區(qū)面積6.15 m2(2.05 m×3.00 m)。

根據(jù)不同藥劑有效成分含量、推薦使用劑量及試驗地棉花黃萎病的發(fā)病表現(xiàn)，每種藥劑設(shè)置3個施藥量水平?？莶菅挎邨U菌可濕粉劑，記為T1處理，3個施藥量分別為15.0 kg/hm2、30.0 kg/hm2、45.0 kg/hm2；“施倍健”哈茨木霉菌劑，記為T2處理，3個施藥量分別為15.0 kg/hm2、18.0 kg/hm2、24.0 kg/hm2；渝峰“99植?！保洖門3處理，3個用藥量分別為15.0 kg/hm2、22.5 kg/hm2、30.0 kg/hm2；以相鄰不施藥劑的棉花為對照，設(shè)為處理T4，除施藥處理外，其余田管措施各處理均相同。根據(jù)當(dāng)?shù)攸S萎病的發(fā)病規(guī)律，在棉花生育前期(6月15日、7月10日)將藥劑分2次施入，各滴施50%。

滴灌施藥方式全部采用移動加壓滴灌模式，于滴水結(jié)束前約2 h內(nèi)進行，將藥劑加入到滴灌系統(tǒng)的配藥箱中，隨水滴入完成施藥。試驗于棉花發(fā)病前期開始施藥，整個生育期滴施2次。

1.4 調(diào)查指標(biāo)及方法

1.4.1 棉花生長性狀及產(chǎn)量指標(biāo)調(diào)查 記錄各處理黃萎病發(fā)病的時間。調(diào)查各生育階段棉花株高，測定各處理棉花的蕾數(shù)(直徑≥3 cm的計數(shù))、果枝臺數(shù)和有效結(jié)鈴數(shù)。

1.4.2 棉花黃萎病發(fā)病率、病指及防效計算 從各處理出現(xiàn)病株起，開始調(diào)查記錄棉田發(fā)病情況。棉花蕾鈴期通過觀察病葉、吐絮期通過觀察棉稈木質(zhì)部顏色變化，統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率、病指和防治效果。調(diào)查記載中按照沈其益5級分級標(biāo)準(zhǔn)[23]表述病情。

發(fā)病率=發(fā)病植株數(shù)/全部調(diào)查植株數(shù)×100%，記作Ri。

病情指數(shù)=發(fā)病植株的總病級數(shù)/全部調(diào)查植株的理論最高總病級數(shù)，記作Di。

防病效果=(CK處理病情指數(shù)-施藥處理病情指數(shù))/CK處理病情指數(shù)×100%。

1.4.3 土壤微生物數(shù)量測定 在棉花吐絮期(9月21日)，采集0 ～ 15 cm土層新鮮土樣，采用平板培養(yǎng)法、分離計數(shù)法測定土壤微生物數(shù)量[24]。其中，細菌分離用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬鈴薯培養(yǎng)基，放線菌采用改良高氏一號培養(yǎng)基。稱取5 g制備好的土壤樣品，加入盛有45 mL無菌水的三角瓶中，在混勻器上振蕩30 min，即成10-1土壤懸浮液。按上述方法依次稀釋成10-2、10-3、10-4的土壤懸浮液。根據(jù)分離的微生物種類選用不同稀釋度的土壤懸浮液，真菌用10-2、細菌用10-4、放線菌用10-3涂板。真菌、細菌板在28 ℃黑暗中培養(yǎng)2 d，而放線菌板培養(yǎng)7 d。記錄每皿各種菌的菌落數(shù)，直至同類微生物的菌落數(shù)不再增加為止。土壤中菌落數(shù)的單位為 cfu/g。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 11.5進行方差分析，并用Duncan’s法進行差異顯著性檢驗(P=0.05)，分析不同施藥量處理對棉花株高、結(jié)鈴數(shù)、黃萎病發(fā)病率、病指、防效及土壤微生物數(shù)量的影響。數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施藥處理對棉花黃萎病的防治效果

通過各生育期棉花黃萎病發(fā)病情況的跟蹤調(diào)查和統(tǒng)計，研究發(fā)現(xiàn)，3種生物藥劑滴施后顯著降低棉田黃萎病的發(fā)病率和病指，不同程度地提高防病效果，每種藥劑不同的施藥量處理防病效果顯著不同(表2)。

發(fā)病率數(shù)據(jù)顯示，棉花蕾期T1、T2、T3 3個處理平均發(fā)病率分別為17.44%、17.94%、9.38%，較對照(40.11%)依次降低56.52%、55.27%、76.61%，降低程度十分顯著(P值分別為0.001、0.002、0.001)。每種藥劑不同施藥量處理對發(fā)病率的影響，T1表現(xiàn)出隨施藥量的增加而顯著降低的趨勢(P=0.011)；T2施藥量由低到高發(fā)病率依次為20.34%、15.36%、18.11%，施藥量18.0 kg/hm2發(fā)病率顯著低于15.0 kg/hm2和24.0 kg/hm2(P=0.007)；T3處理3個施藥量15.0 kg/hm2、22.5 kg/hm2、30.0 kg/hm2發(fā)病率依次為12.22%、8.44%、7.49%，隨施藥量增加發(fā)病率呈現(xiàn)降低趨勢，但中、高施藥量之間差異不大。隨著生育期推進，進入棉花花鈴期、吐絮期，T1、T2、T3、T4各處理平均發(fā)病率分別為26.90%、30.88%、20.62%、52.12%和35.19%、35.16%、30.94%、58.18%，較蕾期棉田發(fā)病明顯增加，但與對照相比，施藥后均不同程度降低黃萎病發(fā)病率，降低效果大小為T3>T1>T2，各處理不同施藥量之間發(fā)病率的變化趨勢與棉花蕾期相一致。

病指數(shù)據(jù)分析顯示，各生育期T1、T2、T3處理病指較對照(T4)降低幅度依次為：蕾期62.00%、71.14%、85.94%，花鈴期45.24%、41.44%、70.69%，吐絮期42.78%、39.99%、63.92%，全生育期總體降低比例49.04%、48.62%、71.55%，T3處理病害程度最輕。各藥劑不同的施藥量下，T1處理隨著施藥量的增加病指顯著降低(P=0.031)，T2處理的中施藥量18.0 kg/hm2其病害程度顯著低于其他施藥水平，T3處理總體上表現(xiàn)為隨施藥量的加大病指依次降低。

基于病指數(shù)據(jù)的防病效果計算結(jié)果顯示，施藥處理T1、T2、T3在不同生育期對棉花黃萎病的防治效果為：蕾期59.30%、68.28%、84.99%，花鈴期46.78%、43.44%、70.19%，吐絮期42.17%、39.33%、62.18%，3種藥劑對棉花黃萎病防治作用顯著，且生育前期防效明顯高于生育后期。每種藥劑施藥量的增減變化對黃萎病抑菌效果差異顯著，其中，T1處理全生育期平均防效隨施藥量的增加顯著提高(P=0.017)，施藥量45.0 kg/hm2防效較15.0 kg/hm2、30.0 kg/hm2提高24.72%、7.09%，符合一般的施藥效應(yīng)；T2處理的防病效果未隨施藥量的增加而增加，防病效果以中施藥量18.0 kg/hm2最明顯；T3處理的防病效果總體上隨施藥量的增加而增加，3個施藥量整個生育期的平均防效依次達到67.97%、72.00%、77.39%，中、高施藥量之間無顯著差異(P=0.073)。

2.2 不同施藥處理對棉花生長性狀的影響

通過棉花生長性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計，研究表明，施用生物藥劑后除對棉花黃萎病害具有不同程度的防治效果外，對棉花的生長發(fā)育及產(chǎn)量也表現(xiàn)出較好的促進作用(表3)。與清水對照相比，T1、T2、T3處理棉花的株高分別增加11.56%、15.50%、18.34%，果枝臺數(shù)分別增加51.07%、31.87%、58.53%，結(jié)蕾數(shù)分別增加60.10%、53.09%、66.29%，有效結(jié)鈴數(shù)分別增加35.67%、8.06%、42.99%，3種生物滴施后對棉花促生作用效果大小表現(xiàn)為T3>T1>T2，這與T3(“99植?！?本身含有多種微量元素、氨基酸和有機活性物質(zhì)密切相關(guān)。

每種藥劑不同的滴施用量對棉花生長及產(chǎn)量因子的影響顯著不同，其中，對株高的影響，T1表現(xiàn)為隨著施藥量的增加顯著增加(P=0.008)；T2和T3處理各施藥量之間差異不大。對果枝數(shù)的影響，T1和T3處理隨施藥量的增加而依次增加(P值分別為0.010、0.009)，T2處理的3個施藥量之間果枝臺數(shù)無顯著差異(P=0.058)。對結(jié)蕾數(shù)和有效結(jié)鈴數(shù)的影響，3種施藥處理均隨施藥量的增加而增加，其中，T2和T3處理的中、高施藥量之間結(jié)蕾數(shù)差異不顯著(P值分別為0.075、0.133)，T2施藥量18.0 kg/hm2、24.0 kg/hm2蕾數(shù)分別為15.23、15.63，T3施藥量22.5 kg/hm2和30.0 kg/hm2蕾數(shù)為16.23、16.60。總體上，各施藥處理均表現(xiàn)為隨施藥量的增加對棉花的促生增產(chǎn)效果顯著增加。

2.3 不同施藥處理對棉田土壤微生物數(shù)量的影響

通過對棉花耕層土壤中微生物的分離計數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)，較不施藥處理，3種生物藥劑隨水滴施后土壤中細菌和放線菌數(shù)量顯著增加(P值分別為0.008、0.035)，而真菌數(shù)量顯著降低(P=0.017)(表4)。T1處理土壤中細菌數(shù)量增加比例顯著高于T2和T3，T3處理土壤真菌數(shù)量降低最明顯。表明生物藥劑施入土壤后豐富了土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)。

表2 不同施藥處理下棉花黃萎病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防病效果Table 2 Disease incidence and disease severity and control efficiency of different biological agents application against cotton Vertilillium wilt

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note:Vertical bars labeled with different lowercase letters are significant difference(P<0.05).The same below.

表3 不同施藥處理下棉花生長表現(xiàn)及產(chǎn)量因子變化Table 3 Changes of different biological agents application on cotton growth and production

每種藥劑不同的施藥量對土壤微生物數(shù)量的影響也顯著不同。T1處理隨著施藥量的增加，細菌數(shù)量分別增加43.74%、50.33%，54.98%，放線菌數(shù)量分別增加11.36%、28.57%、39.06%，真菌數(shù)量分別降低43.52%、46.30%、54.63%，施藥量的增加對土壤真菌數(shù)量的影響顯著(P=0.025)。T2處理土壤細菌和真菌數(shù)量隨著施藥量的增加而顯著增加，而施藥量為18.0 kg/hm2的放線菌數(shù)量高出其他施藥量近2倍，施藥量18.0 kg/hm2對黃萎病的防效顯著高于15.0 kg/hm2和24.0 kg/hm2，可能與土壤放線菌數(shù)量的顯著增加密切相關(guān)。T3處理土壤細菌、放線菌和真菌的數(shù)量增減變化與T1處理趨勢相同，且不同施藥量之間差異顯著。

表4 不同施藥處理下0～15 cm土層土壤微生物數(shù)量變化Table 4 Changes of different biological agents application on soil microbial quantity at 0-15 cm soil layer

3 討 論

本試驗結(jié)果顯示，3種生物藥劑枯草芽孢桿菌劑、木霉菌劑和“99植?！痹诿藁ㄉ捌陔S水滴施后對黃萎病的防病效果顯著提高，全生育期平均防效分別達到52.05%、50.33%和72.46%，但并不都是隨施藥量的增加而增加。其中，枯草芽孢桿菌劑處理黃萎病的發(fā)病率、病指隨施藥量增加顯著降低，防病效果明顯增加，在45.0 kg/hm2的高施藥量下可達到59.23%，符合一般的施藥效應(yīng)，而木霉菌劑施藥量18.0 kg/hm2的防病效果顯著高于15.0 kg/hm2和24.0 kg/hm2，“99植保”施藥量22.5 kg/hm2、30.0 kg/hm2之間差異并不明顯。目前，生產(chǎn)上用于防治棉花黃萎病的生物農(nóng)藥相對較少，報道較多的主要有枯草芽孢桿菌制劑、木霉菌制劑、“99植?！薄被烟撬?、植物激活蛋白、寧南霉素等，相關(guān)的藥效試驗數(shù)據(jù)顯示，不同的植棉區(qū)因土壤環(huán)境等不同，生物藥劑的施藥方式不同，在施藥量上存在顯著差異[20, 25-30]。生物藥劑以滴灌的方式隨水施入土壤，合適的施用量對于藥效作用的發(fā)揮尤為關(guān)鍵。生物藥劑尤其是微生物菌劑，如果用量過少，藥劑本身的抗病菌不能穩(wěn)定繁殖并在根際微生物群落中占據(jù)優(yōu)勢地位，就無法與土壤病原菌形成有效競爭；如果施用量過多，勢必會對土壤其他有益菌群產(chǎn)生影響，也必然影響防病效果[21, 31]。另外，試驗還發(fā)現(xiàn)，棉花生育前期防效明顯高于生育后期，原因可能是生防菌進入土壤并且生長繁殖，打破原有的土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)，但隨著時間的推移，這種被破壞的微生態(tài)平衡會趨于恢復(fù)正常[32]。

本研究顯示，3種生物藥劑滴施后除棉花黃萎病害具有不同程度的防病效果外，對棉花的生長發(fā)育及產(chǎn)量也表現(xiàn)出一定的促進作用，尤其表現(xiàn)在果枝數(shù)和蕾鈴數(shù)的顯著增加，這種促生效果基本上與施藥量呈正相關(guān)。本試驗前期開展生物藥劑施用對土壤理化性狀的影響研究，發(fā)現(xiàn)滴施枯草芽孢桿菌劑、木霉菌劑和“99植保”后土壤有機質(zhì)含量分別增加33.91%、25.14%和45.29%。土壤有機質(zhì)是微生物生命活動的重要碳源，而土壤微生物是土壤養(yǎng)分分解和轉(zhuǎn)化的活性庫，表明生物藥劑滴施后促進土壤養(yǎng)分的釋放，養(yǎng)分隨棉花根系的生長會不斷向地上部分輸送，從而為地上植株的生長發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，3種藥劑滴施后對土壤微生物結(jié)構(gòu)具有明顯改善作用，其中，土壤細菌數(shù)量隨施藥量的增加呈倍數(shù)增加，枯草芽孢桿菌劑和“99植?！碧幚黼S施藥量增加真菌數(shù)量有不同程度的降低、放線菌數(shù)量依次增加，施藥量為18.0 kg/hm2時木霉菌劑的放線菌數(shù)量高出其他施藥量的近2倍，而該施藥量的防病效果也顯著高于另外兩個施藥量。諸多學(xué)者研究表明，植物健康狀況與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)[34-36]。生物藥劑施入土壤必然會引起土壤微生物數(shù)量變化，而土壤微生物之間，又通過錯綜復(fù)雜的作用，影響不同物種的增減消漲，從而間接影響地上植株的抗病性和生長代謝。

4 結(jié) 論

通過綜合分析棉花黃萎病防病率及防病效果、生長表現(xiàn)和土壤微生物數(shù)量變化，本試驗條件下3種生物藥劑隨水滴施對棉花防病促生大小依次為渝峰“99植?！?、“施倍健”哈茨木霉菌劑、枯草芽孢桿菌劑。渝峰“99植?！彪S施藥量的增加，棉田黃萎病發(fā)病率顯著降低、果枝數(shù)和蕾鈴數(shù)明顯增加，但施藥量22.5 kg/hm2與30.0 kg/hm2差異不大；“施倍健”哈茨木霉菌劑施藥量18.0 kg/hm2的防病效果顯著高于15.0 kg/hm2和24.0 kg/hm2，但18.0 kg/hm2與24.0 kg/hm2對棉花生長表現(xiàn)及增產(chǎn)效果差異不明顯；枯草芽孢桿菌劑的防病效果及促生作用隨施藥量的增加而顯著增加?？紤]生物藥劑成本較高，所以生產(chǎn)中對于黃萎病害較為嚴重的棉田，建議3種生物藥劑的滴施用量為：渝峰“99植保”22.5 kg/hm2、“施倍健”哈茨木霉菌劑18.0 kg/hm2、枯草芽孢桿菌可濕粉劑45.0 kg/hm2。

生物藥劑施入土壤藥效的發(fā)揮需要一定的周期，故合適的施藥時間很關(guān)鍵；另外，生物藥劑藥效較慢且不穩(wěn)定，單施成本較高。因此，滴施最佳時間以及不同生物藥劑與有機肥配施是今后的研究方向。