宋肖潔 史曉婷 姚期鳳 吳越

200233上海，伽藍（集團）股份有限公司研發(fā)中心

三維皮膚模型是應用細胞生物學和工程學的技術和原理，在體外利用人正常皮膚細胞構建具有完整三維解剖結構、高度模擬人體皮膚的組織模型。組織工程技術的發(fā)展，以及制藥業(yè)和化妝品行業(yè)對動物替代方法的巨大需求，推動了體外重建皮膚模型技術的進步。我們嘗試使用來自中國人的皮膚細胞構建包含表皮-真皮結構的三維全層皮膚模型，并從形態(tài)學、超微結構以及特征蛋白表達方面對三維皮膚模型進行測試評估，以期將其應用于皮膚屏障、傷口愈合等皮膚相關的基礎研究，以及和化妝品相關的安全性和功效性評估。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

本研究通過上海芯超生物科技有限公司倫理委員會批準（YBM-05-02），健康人皮膚組織來自上海芯超·生物樣本庫。角質形成細胞無血清培養(yǎng)基（KSFM）、DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），豬膠原（北京金泰宏達生物科技有限公司），胎牛血清（美國Thermo公司），噻唑藍（MTT）、曲拉通X-100（Triton X-100）（美國Sigma公司），OCT試劑（美國SAKURA公司）；一抗鼠抗人角蛋白10（K10）抗體、Ki67抗體、免疫組化試劑盒（丹麥Dako公司），鼠抗人轉谷氨酰胺酶（TG）、原纖維蛋白抗體（fibrillin，美國Thermo公司），鼠抗人層黏連蛋白5抗體（laminin 5，美國Millipore公司），兔抗人Ⅲ型膠原抗體（COLⅢ，法國Novotec公司），鼠抗人Ⅳ型膠原（COLⅣ）（美國Santa Cruz公司）、Ⅰ型膠原（COLⅠ，英國Abcam公司）、絲聚合蛋白（filaggrin，美國Vector labs公司）抗體，二抗驢抗鼠Alexa Fluor?568、羊抗兔Alexa Fluor?568（美國Life technologies公司），熒光/化學發(fā)光酶標儀（美國PerkinElemer公司），普通/熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）。

二、皮膚模型制備

1.原代皮膚細胞提取：人成纖維細胞及人角質形成細胞的提取參見文獻［1］，將皮膚組織沖洗后置于含0.25%～0.5%分離酶的PBS溶液，4℃過夜；次日，分離真表皮，表皮部分使用0.5%胰酶室溫消化15 min，無菌不銹鋼濾網(wǎng)過濾后得到人角質形成細胞單細胞懸液，真皮部分使用含0.2%膠原酶的DMEM溶液于37℃消化2～6 h，過濾得到人成纖維細胞單細胞懸液，分別計數(shù)、傳代培養(yǎng)或凍存。

2.真皮層制備：將獲得的人成纖維細胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。用超純水溶解豬膠原，取第5～10代的成纖維細胞，按照0.5×106/ml～3×106/ml的密度接種至已經(jīng)溶解的膠原中，膠原濃度為0.4 g/ml；然后將此膠原和成纖維細胞的混合物倒于細胞培養(yǎng)皿中，待膠原凝固后，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，每隔48 h更換1次培養(yǎng)基，以接種成纖維細胞作為皮膚模型培養(yǎng)的第0天，記為D0。

3.表皮層制備：將從皮膚組織提取的人角質形成細胞使用KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種成纖維細胞后皮膚模型培養(yǎng)的第3天（D3），將準備好的第3～7代角質形成細胞按照0.1×105～1.5×105個/cm2接種于真皮層表面，按文獻［2］配制培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃培養(yǎng)，每隔48 h換液1次，持續(xù)培養(yǎng)2周，培養(yǎng)結束后將皮膚模型放到OCT試劑中-20℃凍存，制備常規(guī)冷凍切片，或浸泡到4%甲醛中固定24 h，然后進行常規(guī)石蠟切片的脫水和包埋。

三、皮膚模型形態(tài)學觀察

將石蠟切片脫蠟復水后，通過HE染色對培養(yǎng)得到的三維皮膚模型的組織結構進行觀察，并與正常人皮膚組織進行對比；通過Masson染色進一步觀察D17、D18、D19、D20、D24和D31時三維皮膚模型的表皮層變化。通過HE或Masson染色觀察到該模型真皮中有活的成纖維細胞，表皮層分化良好，各層結構清晰且具有角質層，即可視為得到雙層皮膚模型。

四、皮膚模型超微結構的電鏡觀察

將皮膚模型切成1～2 mm寬的細長條，戊二醛和鋨酸雙固定，常規(guī)制作透射電鏡樣本，然后對皮膚模型真皮層、基底膜、表皮層中的超微結構進行觀察并拍照記錄。

五、皮膚模型中各層標記物的檢測

1.免疫熒光染色檢測TG、K10、COLⅢ、COLⅣ、laminin 5和fibrillin表達：將冰凍切片放在冷甲醛中固定10 min，再放入PBS中清洗2次，各5 min，加入0.5%牛血清蛋白封閉1 h后，加入上述蛋白的一抗（TG抗體1∶1 000稀釋，fibrillin抗體1∶50稀釋，其余抗體均按1∶100稀釋），過夜。次日，PBS清洗2次，各5 min，再加入二抗孵育1 h。PBS清洗，封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2.免疫組化染色檢測皮膚模型中filaggrin、Ki67和COLⅠ表達：將5 μm石蠟切片浸入100℃檸檬酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH6.0）中30 min，冷卻30 min至室溫，加入上述蛋白的一抗（filaggrin、COLⅠ抗體1∶100稀釋，Ki67抗體1∶50稀釋），孵育1 h后按試劑盒說明書染色，蘇木精核染5 min，光鏡下觀察。

結 果

一、皮膚模型的構建結果及形態(tài)學觀察

按上述方法培養(yǎng)真皮3～4 d，培養(yǎng)表皮14 d，即共培養(yǎng)17 d（D17）時獲得三維皮膚模型。該模型表皮具有較好的層狀結構，包括基底層、棘層、顆粒層和角質層；真皮中具有充盈的膠原，且細胞均勻地分布于真皮層。三維皮膚模型表皮層及真皮層與正常人皮膚相近（圖1）。D17、D18、D19、D20、D24和D31（繼續(xù)培養(yǎng)14 d）時，三維皮膚模型表皮（不含角質層部分）不斷變薄，表皮不斷向上分化，角質層增加，仍具有穩(wěn)定的結構，見圖2。

圖1 皮膚真表皮結構（HE×100）

二、三維皮膚模型的超微結構

透射電鏡下，正在分化的三維皮膚模型的表皮層可觀察到形態(tài)清晰的基底層、棘層、顆粒層和角質層；顆粒層含有透明角質顆粒，角質層含有脂質和角化橋粒（corneodesmosome）；細胞間有橋粒，且真表皮連接處具有完整的基底膜；真皮層可觀察到成纖維細胞和膠原纖維，見圖3。

三、皮膚模型中各層標記物的表達

在正常人皮膚和三維皮膚模型表皮中，TG、filaggrin、Ki67、K10均有明顯表達（圖4）；真表皮交界處COLⅣ及l(fā)aminin5均正常表達（圖5）；真皮層COLⅠ、COLⅢ、fibrillin均正常表達（圖5）。

討 論

圖2 三維皮膚模型表皮層隨培養(yǎng)時間的生長分化（Masson×250）

圖3 三維皮膚模型表皮層、基底膜及真皮超微結構

圖4 正常人皮膚與三維皮膚模型的表皮層免疫組化及免疫熒光染色（×250）

圖5 正常人體皮膚與三維皮膚模型Ⅳ型膠原（COLⅣ）、層黏連蛋白5（laminin 5）、原纖維蛋白（fibrillin）、Ⅲ型膠原（COLⅢ）免疫熒光染色和Ⅰ型膠原（COLⅠ）免疫組化染色（×250）

皮膚模型已成為皮膚組織工程學發(fā)展的重要趨勢。三維皮膚模型的發(fā)展影響了癌癥生物學、藥理學及基礎細胞生物學的一系列研究領域［3-4］。這種模型也正在用于模擬疾?。?］，研究藥物傳播［6］以及人類器官發(fā)育機制［7］。目前重建人皮膚模型主要有表皮模型和全層皮膚模型，市面上用于銷售的幾種模型，已經(jīng)有成熟的檢測方法用以評估樣品對皮膚的腐蝕性和刺激性［8-16］。隨著新型生物相容性材料研發(fā)以及更復雜的細胞組分的摻入，皮膚模型的發(fā)展得到持續(xù)改進。本研究所構建的皮膚模型是以中國人皮膚來源的成纖維細胞、角質形成細胞為基礎，該模型更符合東方人的皮膚結構特點，可用于篩選適合中國人皮膚的護膚品。

我們使用豬膠原與人成纖維細胞混合培養(yǎng)構建模擬皮膚的真皮層，再在其上層接種人皮膚角質形成細胞，通過真皮培養(yǎng)3～4 d，表皮培養(yǎng)14 d，成功構建三維皮膚模型。通過組化分析可以觀察到表皮上具有較好的層狀結構，包括細胞呈柱狀排列的基底層，具有多層結構的棘層，向上逐步分化呈扁平狀的顆粒層和無細胞核的角質層。真皮層上具有充盈的膠原，且成纖維細胞均勻分布于真皮層。而且角質層厚度隨著接種角質形成細胞后時間增加而增加，繼續(xù)培養(yǎng)14 d仍具有完整的表皮層結構。目前已有的一些皮膚模型，通常模型成熟后僅能維持3～7 d，且最后模型已無完整的表皮層結構，限制了使用模型進行檢測的時間；而本研究用中國人皮膚重建的全層皮膚模型，在模型成熟收獲后（即D17）仍能在體外維持完整結構長達14 d（即D31），并且表皮中仍具有6～7層含活細胞的角質層，大大增加了可供檢測的時間，拓展了皮膚模型用于檢測的范圍和廣度。

屏障功能是表皮的基本屬性，受表皮脂質組成的影響［13-14，17］。電鏡下可觀察到，我們構建的三維皮膚模型表皮層具有多層結構，顆粒層中有透明角質顆粒，角質層中具有角化橋粒和脂質顆粒，它們均有助于屏障功能；角質形成細胞分化也通過分化標記物的表達模式得到驗證；對不同分化階段的標記物染色顯示，該模型與人表皮分化過程相似；與表皮層細胞分化相關的TG正常表達，filaggrin可見于顆粒層細胞中，在基底層中可觀察到與角質形成細胞分化相關的Ki67，早期分化相關的角蛋白K10在基底層以上表達。

電鏡觀察本研究構建的三維皮膚模型，有完整的基底膜。免疫熒光標記可以觀察到基底膜相關蛋白COLⅣ和層黏連蛋白明顯表達，說明該模型構建成功，具有完整的基底膜。同時，電鏡觀察到該三維皮膚模型真皮層具有膠原纖維和成纖維細胞。免疫熒光標記顯示，真皮層中filaggrin、COLⅠ和COLⅢ膠原在三維皮膚模型中的表達類似于正常人皮膚。

總之，用中國人皮膚構建的三維皮膚模型與正常人皮膚具有較高的相似性，可以作為中國化妝品研究的有利工具，也可以用來開發(fā)體外替代物和毒理學測試研究，但和正常皮膚相比，本研究構建的3D皮膚模型沒有黑素細胞、免疫細胞以及神經(jīng)細胞，同時也缺乏毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器。因此不能用于涉及以上細胞及附屬器的生物學研究中。