法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor,FXR)屬于核受體超家族成員之一,本質(zhì)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞核內(nèi)通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮重要的生理功能。研究表明,除了在膽汁酸、糖、脂代謝中具有作用外,FXR還對炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。FXR活化后與炎癥因子基因啟動子區(qū)中DNA特異位點(diǎn)結(jié)合,通過調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[2]。本文以FXR基因?yàn)楹蜻x基因,在中國華東漢族人群中分析FXR基因常見單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)與肺炎膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性,為臨床膿毒癥高危病人早期診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 自2014年2月至2015年2月,參照2001年美國胸科醫(yī)師學(xué)會和危重病醫(yī)學(xué)會制定的膿毒癥診斷和分級標(biāo)準(zhǔn),連續(xù)收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸科收治的由肺部感染導(dǎo)致的膿毒癥病人194例。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥16周歲;(2)漢族,籍貫為江蘇及其周邊地區(qū)(浙江、安徽、上海),相互間無生物學(xué)親緣關(guān)系;(3)膿毒癥診斷明確且原發(fā)感染灶為肺部;(4)病史資料和臨床實(shí)驗(yàn)室檢查和輔助檢查結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院后24 h內(nèi)死亡;(2)具有其他特殊疾病,如獲得性免疫缺陷綜合征、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植后;心、肝、腎、肺、腦等重要器官功能衰竭終末期;(3)曾攝入或應(yīng)用過對炎癥過程有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα, TNF-α)抗體、干擾素-γ等;(4)接受免疫抑制劑和激素治療;(5)孕婦。采用調(diào)查表的形式收集病人的社會人口學(xué)資料(年齡、性別、民族、籍貫、身高、體質(zhì)量)、既往病史、吸煙史、飲酒史、實(shí)驗(yàn)室檢查和輔助檢查結(jié)果、感染部位及膿毒癥診斷基本指標(biāo)(體溫、心率、呼吸頻率、血壓、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、微生物培養(yǎng)結(jié)果)、診斷膿毒癥后24 h內(nèi)急性生理與慢性健康評分(acute physiology and chronic health evaluation, APACHE Ⅱ)等，采用Marshall MODS評分系統(tǒng)[3]計(jì)算住院期間最高多器官功能障礙評分(multiple organ dysfunction score, MODS)、臨床轉(zhuǎn)歸。采用氧合指數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血清膽紅素水平、血壓校正的心率和格拉斯哥昏迷評分對病人呼吸、血液、肝臟、心血管、中樞神經(jīng)、腎臟功能進(jìn)行評分,所得總分即為MODS評分。所有入選病人抽取靜脈血3 mL,枸櫞酸鈉抗凝,-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有受試者均簽署知情同意書。本研究?jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會審核通過(批準(zhǔn)號:2014NZGKJ-024)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 膿毒癥:臨床上有感染證據(jù)或高度可疑感染,合并體溫>38.5 ℃或<36 ℃和白細(xì)胞總數(shù)>12×109或<4×109。膿毒性休克:膿毒癥病人經(jīng)液體復(fù)蘇治療1 h后動脈收縮壓仍<90 mmHg或需要血管活性藥物治療才能維持收縮壓>90 mmHg。多器官功能障礙:住院期間連續(xù)2 d或有3 d MODS評分>12分。根據(jù)最高M(jìn)ODS評分將膿毒癥病人分為輕度器官功能障礙(MODS評分0～8分)組和重度器官功能障礙組(MODS評分9～18分)。

1.3 SNP位點(diǎn)的選擇 在PubMed上查閱文獻(xiàn),找到已發(fā)表的FXR基因上與疾病相關(guān)的SNPs位點(diǎn);同時查閱NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫,找到位于FXR基因功能區(qū)(外顯子、3′及5′非翻譯區(qū))的SNPs位點(diǎn);最后從HapMap數(shù)據(jù)庫中選擇北京漢族人群樣本,以r2>0.8,作為條件,得到標(biāo)簽SNPs(Tag SNPs)。以上得到的SNPs位點(diǎn)且在中國人群中次要等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)大于10%為入選,最終得到11個SNPs,見表1。

1.4 基因分型 采用德國QIAGEN試劑盒提取外周靜脈血DNA。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的多重連接酶檢測反應(yīng)(iMLDR)分型方法。根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫提供的基因組序列自行設(shè)計(jì)引物。PCR過程中設(shè)置陰性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后隨機(jī)雙盲挑取20個標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn),重復(fù)率達(dá)100%。

表1 FXR基因SNPs位點(diǎn)信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)每個SNPs位點(diǎn)的基因型頻率,進(jìn)行g(shù)oodness-of-fit χ2檢驗(yàn),判斷是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用非條件Logistic回歸模型校正年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、基礎(chǔ)疾病和診斷膿毒癥24 h后APACHE Ⅱ評分,在不同的遺傳模式下分析各位點(diǎn)基因型頻率與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共收集膿毒癥病人194例,年齡16～95歲,平均(61.90±18.47)歲,男124例,女70例,60歲以下75例(38.66%)。病原微生物中最常見的革蘭陰性致病菌為銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌;最常見的革蘭陽性球菌為金黃色葡萄球菌。單純真菌感染12例(6.19%),其中曲霉菌感染4例。30.93%的病人未培養(yǎng)出致病微生物。住院期間發(fā)生膿毒性休克51例(26.29%)、重度器官功能障礙41例(21.13%)、死亡57例(29.38%)。各組之間的社會人口學(xué)資料和臨床特征比較見表2。

表2 不同組間社會人口學(xué)和臨床特征比較

注:同組內(nèi)比較,*P<0.05，**P<0.001

2.2 FXR基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 所有位點(diǎn)的頻率分布在膿毒癥組中均符合Hardy-Weinberg平衡。校正年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、基礎(chǔ)疾病后,非條件Logistic 回歸分析顯示,rs17030270 GG基因型發(fā)生重度器官功能障礙的風(fēng)險較AA/AA+GA型增高[OR(95%CI)=7.13(1.83～27.77)和6.98(2.04～23.90)];rs11110411 CC基因型較TT/TT+CT發(fā)生重度器官功能障礙的風(fēng)險增高[OR(95%CI)=4.72(1.24～18.00)和4.13(1.50～11.32)];rs35735TT基因型較GG/GG+GT基因型發(fā)生重度器官功能障礙的風(fēng)險增高[OR(95%CI)=6.52(1.58～26.98)和6.50(1.69～25.02)];rs1030454GG基因型較AA/AA+GA基因型發(fā)生重度器官功能障礙的風(fēng)險降低[OR(95%CI)=0.05(0.01～0.52),和0.09(0.01～0.80)];GA+GG基因型較AA基因型發(fā)生重度器官功能障礙的風(fēng)險降低[OR(95%CI)=0.29(0.12～0.72)],見表3。FXR基因多態(tài)性與膿毒性休克和死亡均無關(guān)。

表3 FXR基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性

3 討論

越來越多的研究表明,FXR具有抗炎作用。FXR敲除小鼠脾巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子增多,對炎癥刺激的敏感性增強(qiáng);鼠結(jié)腸炎模型中,FXR缺陷小鼠較野生型更易于發(fā)生結(jié)腸損害,FXR配體能夠有效地抑制野生型小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)[4];FXR基因敲除小鼠易于發(fā)生內(nèi)毒素性休克,而FXR基因高表達(dá)小鼠更能抵抗內(nèi)毒素性休克。除了通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用外,FXR還可通過其他機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。膽汁淤積是膿毒癥的常見并發(fā)癥且與膿毒癥預(yù)后相關(guān)。血漿中的膽汁酸,尤其是鵝去氧膽酸和去氧膽酸能作為危險相關(guān)分子模式(dangerassociatedmolecularpattern,DAMP),可激活炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性小體,增進(jìn)促炎因子白介素(IL)-1β和IL-18的成熟與釋放,從而加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致不良預(yù)后。預(yù)先給予膽汁酸螯合劑——消膽胺能顯著降低膿毒癥小鼠血漿中膽汁酸和IL-1β的水平,提高生存率。FXR通過調(diào)節(jié)膽汁酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄來維持體內(nèi)膽汁酸水平的穩(wěn)態(tài)。FXR基因敲除鼠血漿膽汁酸水平和IL-1β明顯增高,更易于發(fā)生脂多糖誘導(dǎo)的死亡。體外研究中利用腺病毒轉(zhuǎn)染提高FXR表達(dá)能恢復(fù)血漿膽汁酸水平,降低IL-1β濃度,抑制半胱天冬酶-1(caspase-1)的活性。FXR還能通過直接與NLRP3炎性小體中的NLRP3和caspase-1結(jié)合而抑制NLRP3炎性小體的功能,減少促炎因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[5]。

本研究以FXR基因?yàn)槟摱景Y的候選基因,在194例肺炎膿毒癥病人中發(fā)現(xiàn)FXR基因中有4個SNPs位點(diǎn)與器官功能障礙嚴(yán)重程度相關(guān):rs17030270、rs11110411、rs35735與重度器官功能障礙風(fēng)險增高有關(guān),rs1030454 則與重度器官功能障礙風(fēng)險降低有關(guān)。沒有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)與膿毒性休克或死亡相關(guān)。既往關(guān)于FXR基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性研究主要集中在膽石癥、糖脂代謝紊亂、腫瘤等[6-8],而與炎癥或感染性疾病的相關(guān)性研究較少。目前未見有FXR基因多態(tài)性與膿毒癥的相關(guān)性研究報道。Attinkara等[9]在歐洲人中的研究發(fā)現(xiàn),FXR基因rs56163822T等位基因能夠增加炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD)的風(fēng)險,但在不同人群中,結(jié)論不一致,Nijmeijer等[10]對荷蘭人的研究中沒有發(fā)現(xiàn)此種相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)FXR基因中有4個SNPs位點(diǎn)(rs17030270、rs11110411、rs35735、rs1030454)與肺炎膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān),這4個位點(diǎn)均位于內(nèi)含子中,且既往研究報道較少,其與疾病的關(guān)系和功能還不清楚。內(nèi)含子區(qū)突變可能通過影響mRNA的剪切、穩(wěn)定性或定位來影響基因的功能[11],也可能是這些陽性位點(diǎn)因和其他與膿毒癥有關(guān)的SNPs位點(diǎn)連鎖,而表現(xiàn)出與膿毒癥相關(guān),具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)FXR基因多態(tài)性與膿毒癥器官功能障礙相關(guān)。但樣本量較少,統(tǒng)計(jì)效力不夠,導(dǎo)致一些低外顯率的SNPs位點(diǎn)的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)不了,也不排除陽性位點(diǎn)因和其他與膿毒癥有關(guān)的SNPs位點(diǎn)連鎖,而表現(xiàn)出與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)。因此還需要擴(kuò)大樣本量對研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。