李國烈，杜 鑫，蘇 旭，覃明麗，蔣金芳

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川 南充 637000)

吡蟲啉和啶蟲脒是新一代煙堿類農(nóng)藥，具有殺蟲譜廣、持效期長、內(nèi)吸性強、不易揮發(fā)、高效、低毒等特點[1-2]。吡蟲啉能有效防治鞘翅目、同翅目、鱗翅目和雙翅目類害蟲，同時可殺滅對有機磷農(nóng)藥等傳統(tǒng)殺蟲劑有抗藥性的害蟲[3-4]。啶蟲脒是吡蟲啉的一種開環(huán)衍生物，除具有吡蟲啉良好的殺蟲活性外，還有優(yōu)良的殺卵活性，而且與常規(guī)農(nóng)藥無交互抗性[5]。由于這兩種殺蟲劑的顯著優(yōu)勢，近年來被廣泛用于果桑生產(chǎn)中，主要用于防治桑木虱、白粉虱、蚜蟲、桑毛蟲、桑椹癭蚊、桑尺蠖、桑天牛、桑薊馬和紅蜘蛛等病蟲害[6-11]。但在實際生產(chǎn)中，由于用藥不當會造成桑葚中化學農(nóng)藥殘留污染，危害人類健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[12]。到目前為止，尚未見關(guān)于吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的殘留檢測報道。本試驗建立了桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品和試劑 吡蟲啉和啶蟲脒(Krexiom-methyl)標準品購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所(編號分別為GSB-1890-2008和SB-108-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均為色譜級，購自Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，搖床(IKA，HS501)，離心機(Sigma，3-18KS)，氮吹儀(Organomation，N-EVAP112)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取裝置(Agilent)，50mL離心管(Eppendorf)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22μm)等。

1.3 樣品前處理 準確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00g于50mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，置于搖床上振搖30min，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈震蕩1min，置于離心機中10 000r/min離心10min，移取上清液10.00 mL待凈化。

1.4 樣品凈化 將移取的10.00 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)預淋洗Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脫，合并淋洗液，于40℃氮吹吹至近干，用5.00mL 50%甲醇定容，旋渦混合器混勻后過0.22μm濾膜，待檢測。

1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 流動相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，洗脫程序(表1)，流動相使用前用超聲波脫氣。色譜柱溫：35℃，樣品室溫度16℃，進樣量：2μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應監(jiān)測(MRM)方式進行采集，相關(guān)參數(shù)(表2)。

表1 流動相及梯度洗脫條件

續(xù)表

表2 測定吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中殘留的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 標準曲線和檢測限 分別取一定量的吡蟲啉和啶蟲脒標品溶液用桑葚空白基質(zhì)配制成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00μg/L的基質(zhì)標準溶液，采用1.5儀器條件進行分析，以吡蟲啉和啶蟲脒定量離子的峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標作標準曲線，并進行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標準曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進行測定，采用Masslynx V4.1軟件計算吡蟲啉和啶蟲脒的信噪比(S/N)，以S/N≥3時的樣品濃度為方法檢測限[13]。

1.7 回收率 回收率試驗采用加標回收試驗法。

回收率(%)=樣品實測濃度/樣品理論濃度×100%。

取桑葚空白樣品，根據(jù)高、中、低3個濃度分別加入相應的吡蟲啉和啶蟲脒標準溶液，每個濃度水平做6個平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標準曲線計算樣品的實測濃度與樣品理論濃度的百分比。

1.8 精密度 精密度試驗采用加入法。取桑葚空白樣品，根據(jù)高、中、低3個濃度分別加入相應的吡蟲啉和啶蟲脒標準溶液，每個濃度水平做6個平行。所有樣品按1.3和1.4進行樣品前處理，采用1.5儀器條件測定藥物濃度，連續(xù)測定3d，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標準曲線計算樣品的實測濃度，即可求得方法的日內(nèi)和日間精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇性 該試驗條件下，吡蟲啉和啶蟲脒采用反相液相色譜分離，流動相中加入0.1%體積分數(shù)的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明，吡蟲啉和啶蟲脒保留時間分別為3.69min和3.92min，峰形及分離度良好，且可獲得較強的分子離子峰強度，桑葚基質(zhì)對桑葚樣品中吡蟲啉和啶蟲脒的測定無干擾。吡蟲啉基質(zhì)標準溶液圖譜，桑葚空白樣品圖譜和桑葚加標樣品圖譜(圖1、圖2和圖3)，啶蟲脒基質(zhì)標準溶液圖譜，桑葚空白樣品圖譜和桑葚加標樣品圖譜(圖4、圖5和圖6)。

圖1 吡蟲啉基質(zhì)標準溶液圖譜(1.00μg/L)

圖2 桑葚空白樣品圖譜

圖3 桑葚加標樣品圖譜(1.00μg/kg)

圖4 啶蟲脒基質(zhì)標準溶液圖譜(1.00μg/L)

圖5 桑葚空白樣品圖譜

圖6 桑葚加標樣品圖譜(1.00μg/kg)

2.2 標準曲線和檢測限 吡蟲啉和啶蟲脒基質(zhì)匹配標準曲線在質(zhì)量濃度0.10～100.00μg/L時線性關(guān)系良好，標準曲線回歸方程分別為y=1.361 4×104x+6 547(R2=0.999)和y=7.074 2×104x+68 113(R2=0.997)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測限，吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的方法檢出限(method detection limit，MDL)均為0.02μg/kg。以4倍MDL為測定下限[11]，即4倍方法檢出限濃度作為測定下限，則吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的測定下限為0.10μg/kg。

2.3 回收率 吡蟲啉和啶蟲脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3個濃度下的桑葚添加樣品回收率分別為106.45%、94.46%、92.54%和90.47%、94.93%、86.88%，相對標準偏差均在5.00%以內(nèi)，(表3)，表明該試驗方法在測定桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留時具有較好的回收率。

表3 桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒回收率(n=6)

2.4 日內(nèi)精密度和日間精密度 該試驗條件下，吡蟲啉和啶蟲脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3個濃度的桑葚添加樣品日內(nèi)精密度相對標準偏差分別為2.68%、3.66%、2.77%和2.52%、3.09%、3.27%，日間精密度相對標準偏差分別為3.47%、4.65%、4.01%和3.55%、4.56%、3.98%，(表4)。結(jié)果表明，該試驗方法在檢測桑葚中的吡蟲啉和啶蟲脒時，具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表4 桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

3 討論

該試驗樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復合柱凈化，超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的殘留，該方法前處理過程操作簡便，方法的選擇性、標準曲線、檢測限、回收率和精密度均滿足樣品分析方法要求。該試驗采用空白基質(zhì)匹配標準校正法來降低和消除基質(zhì)效應對檢測結(jié)果的影響。