陳艷慧 俞鳳 邊澤源 洪建明 鐘橋石 杭亞平 張楠 胡龍華

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科 江西醫(yī)學(xué)檢驗重點實驗室；2.江西省胸科醫(yī)院；3.南昌市第九醫(yī)院，南昌 330006)

新生隱球菌是一類擔(dān)子菌類的酵母菌，能引起免疫功能不全患者和健康人較高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)估計，全球每年約有960 000例HIV相關(guān)的隱球菌病[1]。令人可怕的是，在一些抗病毒和抗真菌治療條件有限的地區(qū)，大約60%的HIV患者在感染隱球菌后立即死亡[1]；如果沒有使用特定的抗真菌藥物治療，則入住醫(yī)療機構(gòu)治療2周內(nèi)的死亡率達100%[2]。隨著HIV的流行，HIV相關(guān)性隱球菌病的發(fā)病率和死亡率逐漸增加，尤其在南非和東南亞地區(qū)[3]。先前研究顯示，在我國，HIV相關(guān)隱球菌病發(fā)病率僅為12.9%～24.7%[4]，近兩年有研究表明四川和江西地區(qū)HIV相關(guān)隱球菌病發(fā)病率均大于40.0%[5-6],高于全國統(tǒng)計水平。然而，我國對HIV患者新生隱球菌感染的分子流行病學(xué)研究較少，故收集本地區(qū)34株分離自HIV患者的新生隱球菌，分析其耐藥性、毒力表型、基因型、交配型、血清型及ST型，旨在為HIV患者新生隱球菌感染的預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集江西省多家醫(yī)院2016年1月～2017年12月HIV患者首次分離的新生隱球菌34株。所有菌株均經(jīng)VITEK MS質(zhì)譜儀 (法國梅里埃)和特異性引物SOD1進行鑒定，同時對患者資料進行回顧性調(diào)查。標準菌株：WM148 (serotype A, VNI)。

1.2 藥敏實驗和毒力表型檢測

采用ATB Fungus 3 (法國梅里埃)測定34株新生隱球菌對常用抗真菌藥物氟康唑 (FCA)、5-氟胞嘧啶 (5FC)、伊曲康唑 (ITR)、伏立康唑 (VRC)和兩性霉素B (AMB)的敏感性。判讀標準參照2008版CLSI文件。CandidaparapsilosisATCC22019和CandidakruseiATCC6258作質(zhì)量控制。用印度墨汁染色觀察莢膜厚度，尿素酶實驗和37℃生長實驗檢測新生隱球菌的毒力表型特征。

1.3 DNA提取

參照Alessandro等[7]的快速DNA提取方法進行操作。4℃保存抽提出的DNA。

1.4 血清型和交配型確定

參考Yan等[8]的方法，采用血清型和交配型特異性引物 (STE20Aa、STE20Aα、STE20Da和STE20Dα)進行PCR特異性擴增。標準菌株：H99 (serotype A, MATα), JEC21 (serotype D, MATα)和JEC20 (serotype D, MATa)。引物序列和反應(yīng)條件見表1。

1.5 MLST分型

根據(jù)國際人類和動物真菌學(xué)會 (ISHAM)的共識方案[9]，對新生隱球菌的7個管家基因CAP59、GDP1、LAC1、PLB1、URA5、IGS1、SOD1進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物測序后，將所有測序結(jié)果提交至NCBI。

(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫獲得GenBank登錄號并通過新生隱球菌/格特隱球菌復(fù)合群數(shù)據(jù)庫 (http://mlst.mycologylab.com)確定每株菌的序列型 (sequence type, ST)。引物序列和反應(yīng)條件見表1。

1.6 PCR擴增及電泳

采用25 μL PCR反應(yīng)體系：上下游引物 (10 μmol/L)各1 μL,模板1 μL, 2xTaq PCR Mastermix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL。以DL2000 TM DNA Marker作為參照，吸取4 μL PCR產(chǎn)物加樣在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓100 V,時間50 min。

2 結(jié) 果

2.1 患者資料

34株新生隱球菌為2016年1月～2017年12月從江西省多家醫(yī)院HIV患者中分離，男性多于女性，比例為2.4∶1；年齡分布范圍為22～69歲 (中位年齡為38.7歲)，見表2。大部分患者以頭痛、嘔吐、發(fā)熱、腦膜刺激征等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀就診，少部分患者有不同程度視力下降、視物模糊或意識障礙。患者入院初次腦脊液壓力平均為 (27.26±11.52) mmH2O，CD4細胞計數(shù)中位數(shù)28 cells/μL (3～163 cells/μL )，腦脊液白細胞中位計數(shù)32 (2～110)×106/L，蛋白質(zhì)定量中位數(shù)為362 mg/L (160～2 730 mg/L)，葡萄糖含量中位數(shù)為2.28 mmol/L (1.50～5.98 mmol/L)。

2.2 菌株分布、毒力表型及藥敏結(jié)果

表1 PCR引物序列和反應(yīng)條件

本次分析的34株新生隱球菌中，首次分離自腦脊液的占大部分 (n=25, 73.5%)，余下的首次分離于血液 (n=9, 26.5%)，見表2，其中腦脊液和血液都培養(yǎng)出新生隱球菌僅占14.7%。所有菌株在37℃溫箱培養(yǎng)24 h后均可見菌落生長；在尿素瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，均呈紅色；經(jīng)墨汁染色后在鏡下觀察，均可見隱球菌莢膜清晰及芽生孢子結(jié)構(gòu)。所有菌株對5種常用抗真菌藥物氟康唑、5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑和兩性霉素B都敏感，見表2。

2.3 血清型、交配型、基因型和ST型

所有新生隱球菌血清型均為A型，交配型為α，基因型為VNⅠ。MLST分析共檢出3種ST型，包括ST5 (n=32)、ST32 (n=1)和ST186 (n=1)。CN30 (ST32)來自江西上饒，CN90 (ST186)來自于江西鷹潭，ST5在江西省各個地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，見表2。

3 討 論

在HIV流行的時代，盡管進行積極抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療，但是新生隱球菌仍是威脅艾滋病患者生命的嚴重機會致病菌，是南非地區(qū)導(dǎo)致感染性疾病死亡的第四大元兇[10]。根據(jù)最近的分類研究，隱球菌病主要由新生隱球菌和格特隱球菌引起，新生隱球菌包括3個血清型 (A,D,和AD)和4個基因型 (VNⅠ,VNB/VNⅡ,VNⅢ和VNⅣ)，且主要引起艾滋病患者感染；格特隱球菌包括2個血清型 (B和C)和4個基因型 (VGⅠ,VGⅡ,VGⅢ和VGⅣ),且地理分布局限，主要分離自免疫正常個體。在HIV合并隱球菌感染的人群當(dāng)中，除了積極抗病毒治療還應(yīng)長期抗真菌治療，而長時間的抗真菌治療將導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。因此，了解新生隱球菌的流行病學(xué)、種群構(gòu)成、進化，將有助于提高臨床醫(yī)生預(yù)防和治療新生隱球菌感染的能力。

表2 34株新生隱球菌的信息和藥敏結(jié)果

34例HIV患者中，男性患者是女性的2.4倍，且中位年齡為38.7歲，與非洲的女性多于男性，中位年齡為35歲稍有不同[11]。和大多數(shù)研究一樣，新生隱球菌主要侵犯HIV患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本次研究的大部分患者有頭痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱、腦膜刺激征陽性等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，少部分患者有不同程度視力下降、視物模糊或意識障礙。其中不同ST型菌株 (ST5，ST32，ST186)感染的患者臨床表現(xiàn)無明顯差異。HIV患者免疫水平低下，起病隱匿，進展緩慢，有研究顯示CD4細胞計數(shù)<20 cells/μL是患者死亡的風(fēng)險因素 (OR=18.0，P=0.037)[12]。患者顱內(nèi)壓明顯升高，且在誘導(dǎo)治療期間可進一步升高，有研究報道[13]，顱內(nèi)壓的變化對腦脊液的抗菌藥物濃度無影響，但降顱內(nèi)壓也是治療的關(guān)鍵。我們的結(jié)果顯示腦脊液白細胞升高不明顯，腦脊液蛋白水平較高，與Boulware等[14]和Abhilash等[13]的研究結(jié)果不一致，且初始腦脊液白細胞≤25 cells/μL,蛋白≤50 g/L與免疫重建炎癥反應(yīng)綜合征 (immune reconstitution inflammatory syndrome，IRIS)的發(fā)展有關(guān)[14]。 腦脊液葡萄糖低于正常值。

表2顯示34株新生隱球菌中，大部分 (73.5%)首次分離自腦脊液，首次分離于血液僅占 (26.5%)，且查閱患者臨床病歷發(fā)現(xiàn)腦脊液和血液都培養(yǎng)出新生隱球菌僅占14.7%，表明新生隱球菌主要引起HIV患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，同時也能夠血行散播，并且在同時送腦脊液和血培養(yǎng)情況下，腦脊液報陽性時間更早，原因可能是腦脊液中菌量更多。墨汁染色鏡檢顯示，所有菌株可見完整較厚莢膜，可以幫助菌體逃避宿主免疫細胞的吞噬；37℃生長良好，尿素酶實驗陽性，未發(fā)現(xiàn)表型變異株。藥敏結(jié)果顯示，所有菌株對5種抗真菌藥物都敏感，即是如此，仍有部分菌株對有些抗菌藥物表現(xiàn)出較高的MIC，提示我們應(yīng)密切關(guān)注其耐藥性變遷，進一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前提倡的兩性霉素B聯(lián)合氟胞嘧啶標準初始治療仍較適合。本研究未發(fā)現(xiàn)抗真菌藥的MIC值與地理區(qū)域或菌株的ST型之間存在關(guān)系。

本次研究的所有新生隱球菌表現(xiàn)出相同的血清型A，交配型α和基因型VNⅠ，同時也是全球主要的新生隱球菌家族[15]。Feng等[16]的研究表明血清型A，交配型α和基因型VNⅠ同樣是非HIV感染患者新生隱球菌的主要血統(tǒng)。研究結(jié)果表明，我國HIV患者和非HIV患者分離的隱球菌的亞種無差異。和巴西研究感染HIV患者新生隱球菌的基因多樣性不同[17]，本次研究僅檢出3個ST型，絕大多數(shù)為ST5，ST32和ST186各1株。ST5普遍存在東亞國家，包括中國、日本、韓國，且感染免疫缺陷和免疫功能正常者之間無差異[18-20]?？赡苁荢T5相對其他型更具有毒性，也可能是ST5起源于東亞且逐漸適應(yīng)了環(huán)境。到目前為止，ST186在地理位置上是獨一無二的，僅在上海被發(fā)現(xiàn)；ST32在日本，越南和泰國僅有個別案例報道，此次研究為中國首次發(fā)現(xiàn)。由于ST32患者臨床資料有限，我們無法確定感染源，感染獲得可能通過移民或旅游，也可能通過候鳥傳播。

綜上所述，我們的研究揭示了HIV合并新生隱球菌感染的流行病學(xué)模式和臨床特征。本次研究提示近兩年江西省HIV合并新生隱球菌感染主要以中年男性多見，實驗室腦脊液檢查缺乏特異性。首次分離的菌株對臨床常用抗真菌藥物較敏感，后期我們將監(jiān)測抗真菌藥治療后菌株的藥敏情況。研究發(fā)現(xiàn)ST類型較單一，ST5是HIV患者新生隱球菌感染的主要序列類型，與國外研究發(fā)現(xiàn)基因多樣性不同，這可能與本次研究樣本量小，地區(qū)來源單一，時間跨度小存在一定關(guān)系。