姬文蘭，王啟源

(陜西省結(jié)核病防治院 內(nèi)科， 陜西 西安 710100)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)是典型的胞內(nèi)致病菌，存在于宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)[1]。巨噬細(xì)胞凋亡對于寄生于其中的M.tb至關(guān)重要[2]。M.tb可通過多種機(jī)制對巨噬細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控，而這種調(diào)控與其在宿主細(xì)胞內(nèi)的命運密切相關(guān)，對結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有重要影響[3]。因此，巨噬細(xì)胞凋亡的研究可以進(jìn)一步明確M.tb的致病機(jī)制，近年來己成為國內(nèi)外研究分枝桿菌的熱點。

膜聯(lián)蛋白A1(annexin 1，ANXA1)是結(jié)構(gòu)相關(guān)鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族成員之一，參與調(diào)控炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分泌和信號傳導(dǎo)等進(jìn)程[4]。ANXA1作為一個重要的炎性調(diào)控蛋白，主要參與調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)中炎性反應(yīng)，在炎性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞/單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附的過程中起重要作用，可作為誘導(dǎo)免疫炎性紊亂治療的新靶點。ANXA1能夠抑制巨噬細(xì)胞中炎性因子IL-6和TNF的表達(dá)水平[5]。ANXA1缺失小鼠對M.tb感染高度敏感；而且ANXA1在M.tb感染的人外周血單核細(xì)胞中低表達(dá)，表明低表達(dá)的ANXA1在M.tb的免疫逃逸機(jī)制中具有重要作用[6]。此外，ANXA1缺失有損于宿主抵抗M.tb的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[7]。

本研究擬通過探討ANXA1對BCG感染后的RAW246.7促炎細(xì)胞因子及細(xì)胞凋亡率的影響，揭示其對BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性應(yīng)答及凋亡的調(diào)控作用。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步揭示M.tb與巨噬細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制，為新型結(jié)核疫苗的研發(fā)及抗結(jié)核藥物靶點的篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

卡介苗菌株(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG；上海生物制品研究所有限公司)；RAW264.7巨噬細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞研究所)；ANXA1過表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-ANXA1；Ori-Gene公司)，Rrizol試劑盒(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Qiagen公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce公司)；PVDF膜(Millipore公司)；ANXA1、Bax、Bcl-2、caspase- 3和GAPDH抗體(Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Cell Death Detection ELISA kit)(Roche公司)；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)： 將RAW264.7細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 mmol/L青霉素和100 mmol/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。

1.2.2 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌感染RAW264.7巨噬細(xì)胞模型： RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后傳2～3代，待增殖至70%～80%匯合，按照感染復(fù)數(shù)(MOI=細(xì)菌數(shù):細(xì)胞數(shù))為10:1加入BCG菌懸液，輕輕搖勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育。感染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收獲。細(xì)胞模型分為4組：未處理組(未經(jīng)BCG處理組)、對照組(BCG處理組)、mock+BCG組(BCG處理+陰性對照)、ANXA1+BCG組(BCG處理+ANXA1過表達(dá))。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá): 用Trizol法分別提取各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA濃度。將各組細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行操作。參照SYBR Green PCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行實時定量PCR檢測ANXA1及IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)。根據(jù)2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)： 分別收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液RIPA提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，通過半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，加入抗ANXA1、Bax、Bcl-2、caspase- 3、?劆?β-actin和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫?fù)u動孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯影。使用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One分析目的蛋白條帶和GAPDH或β-actin條帶吸光度值，二者的比值為相對表達(dá)量。

1.2.5 ELIAS分析炎性因子含量： 按照ELIAS檢測試劑盒說明書檢測收集到的細(xì)胞上清液中的IL-6和TNF-α的含量。用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm處的吸光值(A值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及對應(yīng)的A值計算樣品濃度。

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞存活率： 用MTT試劑盒檢測各處理組細(xì)胞的存活率。將RAW264.7細(xì)胞加入到96孔板中培養(yǎng)，根據(jù)試驗設(shè)計處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入MTT溶液50 μL，置培養(yǎng)箱繼續(xù)撫育。4 h后吸出上清液，每孔加150 μL DMSO，震蕩搖勻，使用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度值。

1.2.7 ELISA檢測細(xì)胞凋亡： 將RAW264.7細(xì)胞以5×105個/mL接種于6孔板培養(yǎng)皿中，按試驗設(shè)計處理后24 h，用細(xì)胞凋亡ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，參照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BCG感染巨噬細(xì)胞對ANXA1表達(dá)的影響

巨噬細(xì)胞RAW246.7經(jīng)BCG感染后，ANXA1的mRNA表達(dá)在48 h內(nèi)逐漸降低(P<0.05)(圖1A)；ANXA1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖1B)。

2.2 ANXA1抑制BCG誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答進(jìn)程

ANXA1過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率如圖2A-B所示，ANXA1的表達(dá)水平明顯上調(diào)。BCG感染的RAW246.7細(xì)胞中，IL-6和TNF-α的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，ANXA1過表達(dá)明顯抑制BCG感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α表達(dá)(P<0.05)(圖2)。此外，過表達(dá)ANXA1明顯下調(diào)BCG刺激誘導(dǎo)的IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)(P<0.05)(圖2B)。

2.3 ANXA1抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

BCG感染后細(xì)胞的存活率顯著降低；而過表達(dá)ANXA1后存活率有所增加(P<0.05)(圖3A)。BCG處理后細(xì)胞凋亡率明顯上升；而ANXA1過表達(dá)明顯降低BCG感染后的細(xì)胞凋亡率(P<0.05)(圖3B)。

A.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression ofANXA1; B.the protein expression of ANXA1 was determined by Western blot analysis;*P<0.05 compared with 0 hour

A, B.the transfection efficiency of ANXA1 was determined by RT-qPCR and Western blot; C.the level of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were measured by ELISA assay; D.the mRNA expression ofIL-6 andTNF-αwas assayed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with untreated;#P<0.05 compared with mock+BCG

A.the cell viability was detected by MTT assay; B.ELISA was carried out to determine cell apoptosis;*P<0.05 compared with untreated;#P<0.05 compared with mock+BCG

2.4 ANXA1對BCG感染的巨噬細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響

巨噬細(xì)胞RAW246.7經(jīng)BCG感染后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，促凋亡蛋白Bax及caspase- 3蛋白表達(dá)有所升高(P<0.05)(圖4)；而過表達(dá)ANXA1則明顯增高Bcl-2的表達(dá)，同時伴隨Bax與caspase- 3的下調(diào)(P<0.05)(圖4)。

the protein expression of caspase- 3, Bax and Bcl-2 was detected by Western blot analysis, and quantitative analysis；*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with mock+BCG

3 討論

巨噬細(xì)胞在M.tb誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起重要作用。當(dāng)機(jī)體感染M.tb時，首先激活巨噬細(xì)胞以清除M.tb，阻止其體內(nèi)播散，并促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等的釋放，增強機(jī)體對M.tb的殺傷能力[8]。因而，建立分枝桿菌感染細(xì)胞模型對于深入研究炎性應(yīng)答及細(xì)胞凋亡在M.tb感染免疫中的作用是必要的。本實驗選擇牛型結(jié)核分枝桿菌減毒株BCG作為感染菌株，以期了解ANXA1在BCG感染巨噬細(xì)胞RAW246.7的過程中對炎性反應(yīng)及凋亡介導(dǎo)的免疫效應(yīng)的影響，為進(jìn)一步研究參與ANXA1調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答進(jìn)程及凋亡的機(jī)制提供一定實驗依據(jù)。

細(xì)胞因子在M.tb感染的巨噬細(xì)胞中的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，是目前結(jié)核免疫研究的熱點領(lǐng)域之一[9-10]。巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核菌后，會啟動IL-6和TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，防止結(jié)核菌在體內(nèi)擴(kuò)大感染。本研究結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞RAW246.7經(jīng)BCG刺激后，顯著誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的含量，而ANXA1過表達(dá)能夠下調(diào)BCG誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)水平，從而推測ANXA1可抑制BCG感染巨噬細(xì)胞引發(fā)的炎性應(yīng)答進(jìn)程。

巨噬細(xì)胞的凋亡在其抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中的作用呈現(xiàn)復(fù)雜性和和多面性。巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)自身凋亡是殺傷M.tb限制其在體內(nèi)播散的重要機(jī)制之一[11-12]。本研究結(jié)果揭示ANXA1可提高BCG感染的巨噬細(xì)胞的存活率，降低其凋亡率，可上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，并降低了caspase- 3的蛋白表達(dá)量。上述結(jié)果揭示ANXA1通過上調(diào)感染后巨噬細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平、下調(diào)Bax表達(dá)水平，并依賴caspase- 3途徑的凋亡程序，抑制BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。

綜上所述，ANXA1在BCG刺激誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中具有抗炎及抗凋亡作用，在宿主免疫調(diào)節(jié)中具有重要調(diào)控作用，這為進(jìn)一步探究結(jié)核病致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時亦為尋找新的結(jié)核病干預(yù)靶點及結(jié)核病臨床診斷和治療提供新的策略。