張家洧(綜述) 楊云柯(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 上海 200032)

結(jié)直腸癌是當(dāng)今我國最常見的惡性腫瘤之一,其在所有惡性腫瘤中發(fā)病率與死亡率均為第5位,且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。雖然近年來結(jié)直腸癌的治療水平不斷提高,但對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌的治療效果并不理想。肝臟是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的主要器官,超過60%的結(jié)直腸癌患者死亡是由肝轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的[2-3],雖然新型化療藥物及靶向藥物不斷出現(xiàn),但超過95%的新藥在Ⅲ期臨床試驗研究中被證實(shí)對人體無效[4]。

影響Ⅲ期臨床試驗結(jié)果的一個重要因素是現(xiàn)階段缺乏能精確反映藥物療效的臨床前期模型。一般的動物模型不能模擬人體內(nèi)腫瘤微環(huán)境內(nèi)基質(zhì)及免疫成分的功能和腫瘤的異質(zhì)性[5],而有研究表明這些成分恰恰對腫瘤耐藥[6-7]、侵襲[8]、轉(zhuǎn)移[9]及復(fù)發(fā)[10-11]起著重要作用。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,出現(xiàn)了包括致癌物誘導(dǎo)模型(carcinogen-induced models)、基因工程鼠(genetically engineered mouse,GEM)模型及人體腫瘤移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)模型等復(fù)雜模型[12],可以較好地彌補(bǔ)上述不足。本文將對結(jié)直腸癌PDX小鼠模型構(gòu)建及應(yīng)用的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

3種主要的臨床前期模型致癌物誘導(dǎo)模型使用電離輻射及化學(xué)藥物誘發(fā)動物大腸癌,目前常用二甲肼和亞硝胺類化學(xué)物質(zhì)[13-14],該方法簡單、重復(fù)性強(qiáng),短時間內(nèi)可大量復(fù)制,并且可以基本模擬癌變過程,誘發(fā)分化較好的腺癌。但由于轉(zhuǎn)移少見,且人癌發(fā)生原因復(fù)雜,并非都是由已知誘癌劑引起,所發(fā)生腫瘤的病理組織學(xué)類型及其發(fā)展與人腸癌不盡相同,且動物發(fā)癌先后不齊,所需時間較長;此外,實(shí)驗中涉及環(huán)保問題,需要防護(hù)設(shè)施,對實(shí)驗條件要求較高[15]。

基因工程模型利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將腫瘤形成相關(guān)基因直接轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),使建立的腫瘤模型的致癌過程和病理表現(xiàn)更接近人體[16]。但通過基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù),并未能建立單純自發(fā)和轉(zhuǎn)移的小鼠結(jié)直腸癌模型,其病變大多發(fā)生在小腸。因此,目前轉(zhuǎn)基因腸癌模型的相關(guān)研究主要集中在良性腺瘤模型的建立和觀察[17]。

PDX模型是將手術(shù)中獲得的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠,以精確模擬患者腫瘤的生物學(xué)特性[18-19]及不同患者間腫瘤的異質(zhì)性[17,20]。近年來,有關(guān)結(jié)直腸癌PDX模型研究報道的數(shù)量不斷增加。多項研究表明,結(jié)直腸癌PDX 模型在組織病理學(xué)、癌基因表達(dá)以及對藥物的反應(yīng)上,均可較好地復(fù)制原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)[21]。PDX 模型是目前公認(rèn)的理想、精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究平臺,在大腸癌治療方面已經(jīng)取得了初步的成果,但仍然面臨許多問題,如不同腫瘤在PDX模型中成瘤率差異較大(21%～89%)[21-24]。

小鼠選擇不同研究選用的小鼠各不相同,其中以裸鼠及NOD/SCID小鼠最為常見。裸鼠無胸腺,缺乏成熟T細(xì)胞,不產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞,但裸鼠體內(nèi)的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、脾臟和淋巴結(jié)中含有的巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞以及B細(xì)胞和免疫球蛋白均有一定的排斥移植物的作用,其組織移植成瘤率較低(43%～77%)[25-29]。同時有研究表明,裸鼠體內(nèi)存在的B細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮了一定的基因篩選作用,使得原發(fā)腫瘤的某些異質(zhì)性可能會在體內(nèi)傳代中丟失[20]。因此,目前裸鼠用于結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建已逐漸減少。

NOD/SCID小鼠是一種非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠,既有由于DNA修補(bǔ)基因缺陷而導(dǎo)致的T、B細(xì)胞發(fā)育缺陷,又有NOD小鼠所具有的NK 細(xì)胞活性下降、補(bǔ)體活性下降和巨噬細(xì)胞功能缺陷,更適合移植人體腫瘤標(biāo)本,組織移植成瘤率較裸鼠更高(70%～100%)[21,27,30-32],現(xiàn)廣泛用于結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建。

BALB/c裸鼠及SCID小鼠用于結(jié)直腸癌PDX模型也有報道,其組織移植成瘤率較裸鼠高(60%～100%)[22-23,32-33],但移植異種組織時受體內(nèi)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等影響,仍會對其產(chǎn)生免疫反應(yīng),且研究報道較少,綜合結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

近年來,關(guān)于NSG小鼠用于結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建的報道也不斷增加。NSG小鼠具有以下特點(diǎn):(1)缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞,同時樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能減退;(2)缺乏補(bǔ)體活性,淋巴瘤的發(fā)病率非常低;(3)隨著年齡增長也不會產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞;(4)壽命長,對輻射敏感,對微生物病原菌敏感[34]。與NOD/SCID小鼠相比,NSG小鼠的人體細(xì)胞和組織移植成瘤率顯著提高,同時能夠植入更高比例的正?；虬┳?nèi)祟惣?xì)胞和組織。但Chou等[22]報道,使用NSG小鼠構(gòu)建結(jié)直腸癌PDX模型,組織移植成瘤率僅為58%,這可能是受到操作過程、小鼠生存環(huán)境及生存時間的影響。

Brown等[35]總結(jié)了結(jié)直腸癌PDX模型,對不同品系小鼠組織移植成瘤率進(jìn)行了meta分析。結(jié)果顯示NOD/SCID小鼠移植成瘤率最高,可達(dá)78%,其次為BALB/c裸鼠,達(dá)到67%,均高于裸鼠63%的移植成瘤率,且NOD/SCID小鼠與裸鼠的移植成瘤率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1,OR=3.3,95% CI:2.08～5.33)。這對結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建中小鼠品系的選擇有著重要的意義。

移植方式及組織類型選擇PDX模型建立主要有異位移植和原位移植2種。異位移植建立移植瘤模型可分為經(jīng)皮下移植建模及腎被膜下移植建模。Rygaard和Poulsen在1969年最早發(fā)明了經(jīng)皮下移植構(gòu)建PDX模型的方式,具有制備流程簡單、腫瘤大小易測量等優(yōu)點(diǎn),為大規(guī)模制備PDX模型的首選方案。皮下移植建模是將術(shù)中采集的腫瘤組織或處理后的單細(xì)胞懸液移植到裸鼠身體上與腫瘤原發(fā)部位不相關(guān)的部位。應(yīng)用較多的是將腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠皮下(腋部、背部、后肢等),因不影響動物活動而成為較常采用的移植部位[36]。該方法操作簡便,是建立PDX模型的基本方法。有文獻(xiàn)報道,皮下接種時近頭側(cè)成功率較高,這可能和近頭側(cè)血管多,能為腫瘤生長提供豐富營養(yǎng)有關(guān)[37]。但缺陷在于腫瘤細(xì)胞或組織移植后由于有基膜的阻擋,常常局部生長,幾乎不會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,難以模擬患者體內(nèi)發(fā)生的腫瘤轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果與Day等[12]的研究結(jié)果相一致。腎被膜下血供比較豐富,適合腫瘤的生長,但對技術(shù)要求較高。

1982年研究者們改進(jìn)了移植方式,開始進(jìn)行原位移植,原位PDX模型是將術(shù)中采集的腫瘤組織或處理后的單細(xì)胞懸液移植到免疫缺陷動物的相同原發(fā)部位或相關(guān)的轉(zhuǎn)移部位。該模型的制備需要熟練掌握外科手術(shù)技巧。有研究表明,原位PDX模型荷瘤表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲及轉(zhuǎn)移特性。Puig等[31]通過PET和體外組織學(xué)檢測證實(shí)66例原位移植瘤中13例(19.7%)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且多數(shù)為肝肺轉(zhuǎn)移。該模型與原發(fā)腫瘤有最大的相似性,但成瘤率低,建模困難[38]。Puig等[31]報道在NOD/SCID小鼠盲腸壁注射1×106腫瘤單細(xì)胞懸液,移植成瘤率達(dá)88%。Julien等[28]報道在裸鼠盲腸壁黏膜移植50 mm3的腫瘤組織,移植成瘤率達(dá)64%。

各研究中移植的腫瘤組織塊大小并不一致(1～27 mm3),但移植成瘤率與腫瘤組織塊大小并無明顯相關(guān)性:瘤塊太大,早期血管生成的數(shù)量少,瘤組織易因供血不足而缺血壞死;瘤塊太小則不易成瘤,從而降低成瘤率。因此,應(yīng)根據(jù)不同的小鼠模型在免疫缺陷程度、操作要求和生存環(huán)境等方面的實(shí)際需要選擇結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建時腫瘤組織塊大小。

對于移植組織應(yīng)來源于腫瘤原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶,研究結(jié)果顯示兩者在移植成瘤率方面并無差異。這一結(jié)果也在Brown等[35]的報道中得到證實(shí)(P=0.37,OR=0.74,95% CI:0.39～1.4)。這種現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌[39]及黑色素瘤[40]中觀察到的移植組織來源于轉(zhuǎn)移灶組織則移植成瘤率更高的現(xiàn)象并不一致。但Puig等[31]報道,轉(zhuǎn)移灶來源的移植組織較原發(fā)灶來源的移植組織有更短的成瘤潛伏期[(46.6±21.7)天vs. (68±34)天],同時還發(fā)現(xiàn)分化程度高的移植組織較分化程度低的移植組織移植成瘤率更低。盡管尚未得到驗證,但是腫瘤移植前的移植準(zhǔn)備也是至關(guān)重要的。Linnebacher等[27]的研究顯示,新鮮的移植組織與冷藏保存的移植組織在移植成瘤率方面并無差異(74%vs. 71%),但此現(xiàn)象有待于進(jìn)一步的證實(shí)。

PDX模型的應(yīng)用PDX小鼠模型很好地保留了人類腫瘤的基因組特征,還保存了原發(fā)性腫瘤大多數(shù)的關(guān)鍵基因和信號通路活性[41-42]。在一項包含原發(fā)性結(jié)腸癌、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和肝轉(zhuǎn)移組織各1例的結(jié)腸癌PDX模型研究中[22-23],比較父代(F0)和第3代(F3)的組織學(xué)特點(diǎn),3組癌細(xì)胞在形態(tài)、排列方式、核分裂像及分化強(qiáng)度上極其相似。在基因水平的研究中,Guilhamon等[43]對6例結(jié)腸癌患者及其相對應(yīng)的PDX模型的第1代腫瘤進(jìn)行甲基化分析,發(fā)現(xiàn)僅有5個探針位點(diǎn)的改變,而且并未發(fā)現(xiàn)這些變化的位點(diǎn)有任何特殊功能。Chou等[22]對27例結(jié)腸癌PDX模型轉(zhuǎn)錄水平的研究顯示,隨機(jī)選取的2個原位結(jié)腸癌PDX子代及其相應(yīng)的父代轉(zhuǎn)錄類似度分別為0.858和0.942;而其對應(yīng)的F1和F2的轉(zhuǎn)錄相似度更是高達(dá)0.985和0.988。就生長方式而言,部分PDX小鼠模型會出現(xiàn)自發(fā)轉(zhuǎn)移至其他器官(如肺、骨及腹膜等),這些都與患者的臨床表現(xiàn)相似[44]。此外,PDX模型在早期階段保持了患者腫瘤的基質(zhì)成分及腫瘤微環(huán)境,可以用于研究腫瘤微環(huán)境及其對腫瘤的影響[45]。PDX模型在模擬患者體內(nèi)腫瘤的生長模式的基礎(chǔ)上還可以保留腫瘤細(xì)胞基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及關(guān)鍵信號通路特點(diǎn),應(yīng)用范圍也越來越廣,這也是近期PDX小鼠模型的應(yīng)用呈指數(shù)增長的主要原因[46]。目前,PDX模型主要有以下幾種應(yīng)用:

首先,通過PDX模型可以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)志物或新的作用靶點(diǎn)并進(jìn)行驗證,這可以為腫瘤患者個體化治療提供可靠的依據(jù)。例如,利用Kras突變的結(jié)腸癌細(xì)胞株和PDX模型發(fā)現(xiàn)AZD6244 (MEK抑制劑) 發(fā)生耐藥的標(biāo)志物是Wnt通路活化,由此認(rèn)為可以聯(lián)合靶向Wnt和MEK通路達(dá)到抗腫瘤的效果[46]。新的腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對于促進(jìn)臨床-基礎(chǔ)之間的轉(zhuǎn)化研究、整合下一代測序?qū)ふ倚掳悬c(diǎn)和確定PDX小鼠模型的基因組學(xué)特點(diǎn)有著非凡意義,并對依據(jù)腫瘤分子分型制定個體化治療方案有一定的促進(jìn)作用[47]。其次,PDX模型也可以被應(yīng)用于篩選臨床藥物及預(yù)測抗腫瘤藥物療效。研究顯示PDX小鼠模型和腫瘤患者在藥物使用前后的療效上存在著相似性,表明PDX模型具有一定的預(yù)測價值[19,42]。例如,在EGFR抗體西妥昔單抗治療大腸癌時,PDX小鼠模型與患者表現(xiàn)出的反應(yīng)率相似[21,28]。Fichtner等[25]對15 個大腸癌PDX模型進(jìn)行化療研究,在化療過程中5個伴肝轉(zhuǎn)移的PDX 模型顯示的藥物敏感和耐藥反應(yīng)與患者的臨床反應(yīng)有高度的相似性:其中1例患者在接受5-氟尿嘧啶作為新輔助治療后進(jìn)行了肝臟和直腸切除術(shù),但5個月后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,在奧沙利鉑、伊立替康聯(lián)合治療下,病情得到有效控制。在相對應(yīng)的PDX模型中顯示對奧沙利鉑、伊立替康反應(yīng)較好,而對5-氟尿嘧啶耐藥;另1例患者在對5-氟尿嘧啶不敏感的情況下改用奧沙利鉑、伊立替康聯(lián)合治療后,腫瘤標(biāo)志物CEA的水平顯著降低,肝轉(zhuǎn)移灶也明顯縮小,相應(yīng)的PDX模型對奧沙利鉑、伊立替康的敏感性較好,對5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出耐藥;還有2例用5-氟尿嘧啶/甲酰四氫葉酸進(jìn)行化療的患者,在表現(xiàn)出短暫的反應(yīng)后也對5-氟尿嘧啶系統(tǒng)化治療出現(xiàn)耐藥,相應(yīng)的PDX模型對5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出臨界反應(yīng)(T/C=50%)。在這一PDX 模型驗證藥物有效率的研究中,5-氟尿嘧啶的有效率為33%(5/15)、伊立替康和奧沙利鉑的有效率分別為100%(15/15)和57%(8/14),這與相應(yīng)患者的臨床有效率相一致。使用PDX小鼠模型的聯(lián)合臨床試驗可以迅速提高患者分層、認(rèn)識耐藥機(jī)制、優(yōu)化藥物組合和測定生物標(biāo)志物。

構(gòu)建PDX模型面臨的挑戰(zhàn)雖然PDX小鼠模型在篩選個體化用藥方面取得了一定的成就,但是仍然需要更多的研究去攻克PDX小鼠模型存在的不足和缺陷。

構(gòu)建PDX 模型時,會出現(xiàn)人源性間質(zhì)成分在PDX腫瘤組織中丟失的情況,或者在PDX模型體內(nèi)移植人源性非淋巴瘤腫瘤組織容易形成人源性淋巴瘤等問題[35,44]。對于人源性間質(zhì)成分在PDX小鼠模型體內(nèi)的腫瘤組織丟失這個問題,研究者們認(rèn)為這一發(fā)生于基因表達(dá)層面上的問題可能是因為人源性分子探針不能檢測出免疫缺陷小鼠體內(nèi)鼠源性基質(zhì)的相似物[22,28]。大多數(shù)在PDX小鼠模型體內(nèi)形成的淋巴瘤常常都是表達(dá)人CD45的人源性B細(xì)胞型淋巴瘤,且與Epstein-Barr (EB)病毒感染密切相關(guān)[48-49]。推測淋巴瘤形成的原因可能在于免疫缺陷的小鼠體內(nèi)沒有免疫監(jiān)視,受EBV感染后的B淋巴細(xì)胞經(jīng)移植后變換成為增殖狀態(tài)[48]。此外,在PDX小鼠模型中,親代腫瘤的炎癥與人源性淋巴瘤的發(fā)生比例呈正相關(guān),比如胃癌模型淋巴瘤發(fā)生率比大腸癌模型高,就是由于胃癌有較高的基線炎癥率[48]。因此,成功制備PDX小鼠模型需要對生長出來的腫瘤組織進(jìn)行表型復(fù)檢。

其次,腫瘤組織在模型中不生長而導(dǎo)致PDX建模失敗;不同的腫瘤組織類型定植效率也存在非常顯著的差異;而且由于諸多原因,要想制定出符合臨床需求的標(biāo)準(zhǔn)操作程序存在一定的難度。盡管PDX小鼠模型在基因組學(xué)等方面與親代腫瘤接近,但還是不能完全反映患者的腫瘤信息,PDX小鼠模型中的腫瘤可能發(fā)生遺傳、病理組織和微環(huán)境的改變、不同的免疫缺陷小鼠品系會產(chǎn)生不同的實(shí)驗結(jié)果、PDX小鼠模型中的腫瘤只能反映活檢取材時患者的腫瘤情況。而腫瘤是不停進(jìn)化的疾病,進(jìn)化后的腫瘤對PDX小鼠模型上篩選出的藥物可能會發(fā)生不同的反應(yīng)效果。因此,即使成功建立PDX小鼠模型,也不能真實(shí)反映患者的腫瘤情況;進(jìn)行皮下或者原位移植時,腫瘤微環(huán)境的真實(shí)情況也未必能得到準(zhǔn)確反映;一些在患者身上發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤在PDX小鼠模型中未必都會發(fā)生轉(zhuǎn)移。所以這種情況下的研究結(jié)果很難用于指導(dǎo)臨床患者的腫瘤治療;此外,制備和維持PDX小鼠模型常常需要大量經(jīng)費(fèi),增加患者負(fù)擔(dān),且制備PDX小鼠模型也需要較長的等待時間,一些較重的患者可能尚未等到實(shí)驗結(jié)果出來就已經(jīng)死亡。

結(jié)語雖然實(shí)驗動物及移植組織類型及方式的選擇對結(jié)直腸癌PDX模型的構(gòu)建有非常重要的影響,但如上所述仍有諸多因素影響其移植成瘤率(表1),并且對操作技術(shù)要求較高,從手術(shù)室獲取標(biāo)本后需要外科醫(yī)師、組織學(xué)家和研究者密切配合;同時,由于患者來源的腫瘤組織數(shù)量有限,使用上受到醫(yī)學(xué)倫理道德的限制,造成已有的原代模型數(shù)量少。即使在移植瘤形成后,傳代的樣本需進(jìn)行組織病理學(xué)檢測,以確定其與原始樣本的一致性。這些問題都有待于進(jìn)一步研究。

表1 結(jié)直腸癌PDX模型構(gòu)建的影響因素Tab 1 Influence factor of building PDX models of colorectal cancer

aRepresent orthotopic transplantation,others are heterotopic grafts.