李 倩 齊凌云 殷俐娜,,* 王仕穩(wěn), 鄧西平,4

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低氮誘導小麥灌漿期旗葉衰老與膜脂的關系

李 倩1,2齊凌云3,4殷俐娜1,2,3,4,*王仕穩(wěn)1,2,3,4鄧西平1,2,4

1中國科學院大學資源與環(huán)境學院, 北京100049;2中國科學院水利部水土保持研究所 / 黃土高原土壤侵蝕與旱地農業(yè)國家重點實驗室, 陜西楊凌 712100;3西北農林科技大學資源環(huán)境學院, 陜西楊凌 712100;4西北農林科技大學水土保持研究所, 陜西楊凌 712100

小麥產量主要來自于小麥灌漿期旗葉的光合產物, 低氮造成的灌漿期旗葉早衰對小麥產量影響極大。本試驗以小麥品種“長旱58”為試驗材料, 在大田環(huán)境下設置低氮(120 kg hm-2)和正常氮(180 kg hm-2)處理, 研究低氮誘導的小麥旗葉衰老與膜脂的關系。結果表明, 開花14 d后, 低氮處理小麥旗葉的光合速率、葉綠素含量、旗葉總氮含量均顯著降低; 旗葉中膜脂各組分含量均顯著下降, DGDG/MGDG的比值升高; 以C18:3、C18:2為代表的不飽和脂肪酸含量顯著下降, 以C16:0為代表的飽和脂肪酸含量顯著增加, 不飽和雙鍵指數顯著降低; 此外類囊體蛋白質堆積密度也顯著降低。綜合分析認為低氮處理導致小麥灌漿期旗葉早衰, 早衰過程伴隨著膜脂降解和組分改變, 降低了膜的流動性和通透性, 導致葉綠素降解, 使光合功能受損。同時, 植物通過調整DGDG/MGDG比例來響應低氮脅迫, 利用DGDG的雙層特性來部分彌補其它雙層膜脂的降解對膜功能造成的損傷。

小麥; 旗葉; 低氮; 膜脂; 衰老

小麥籽粒產量主要來自灌漿期旗葉的光合產物, 其對籽粒產量的貢獻可達80%以上, 因此維持灌漿期旗葉的光合作用對小麥籽粒產量尤為重要[1]。氮素是葉綠素和色素蛋白復合體的主要成分, 也是組成蛋白質的基本元素, 由缺氮引起的灌漿期旗葉早衰是小麥減產的重要原因之一。灌漿期旗葉早衰導致葉綠素降解, 光合能力降低, 從而限制了同化物的合成和籽粒干物質的積累, 導致產量降低。植物缺氮時在顯微水平表現為葉綠體數目減少, 形狀變的不規(guī)則, 類囊體破裂消失, 嗜鋨顆粒增多, 淀粉粒增大[2-3]; 在生化水平表現為葉綠素合成受阻, 降解速率加快, 光合碳同化酶類如Rubisco活性受到影響, PSII反應中心蛋白含量下降[4]; 在生理水平上表現為葉綠素含量和光合速率的下降[5-6]; 在形態(tài)水平表現為葉片失綠發(fā)黃, 早衰明顯[7]。前人已從自由基產生和清除機制[8-9]、碳氮代謝失衡[10-11]、營養(yǎng)脅迫[12]、內源激素紊亂[13]等角度報道了低氮誘導早衰機制, 并且對于調控低氮誘導的葉片衰老也開展了大量研究, 包括清除自由基防止膜脂過氧化[14], 調節(jié)激素平衡[15], 調控衰老基因表達[16]等。植物葉綠體及類囊體膜在葉片光合作用中發(fā)揮重要作用, 既是光合結構的要件, 也是葉綠素蛋白、糖運輸蛋白等光合作用重要蛋白的載體, 因此光合膜組成和結構的任何改變都將引起葉片結構和功能的改變[17]。在低氮誘導葉片衰老的過程中, 一個顯著特征就是膜的降解和功能的喪失。

在高等植物中, 膜脂是質膜和細胞器膜的組成成分, 主要包括糖脂和磷脂, 糖脂約占膜脂總量的3/4。糖脂主要存在于葉綠體膜和類囊體膜中, 其中單半乳糖甘油二酯(monogalactosyldiacylglycerol, MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(digalactosyldiacy-lglycerol, DGDG)的含量分別為1/2和1/4[18]。當植物遭到逆境脅迫時, 會通過膜脂組成的變化來適應環(huán)境, 而這些變化有助于維持和恢復膜的穩(wěn)定性和完整性, 從而增加植物的脅迫耐受性[19]。在低磷脅迫下, 膜中的磷脂含量降低, 為了維持膜的完整性, 會通過增加膜中的糖脂來替代缺失的磷脂[20]。在干旱脅迫下, 豇豆葉片中單半乳糖甘油二酯合酶基因、雙半乳糖甘油二酯合酶基因的表達量顯著升高, DGDG含量顯著升高, MGDG/DGDG比值降低[21]。過表達的轉基因煙草, 其MGDG和DGDG的含量增加, 植株耐鹽和耐低磷能力顯著提高[22-23]。在臭氧脅迫下, 菠菜葉片質體膜和類囊體膜上的糖脂明顯減少[24]。以上研究結果表明, 膜脂在植物抗逆中起著重要的作用。

近年研究表明, 低氮脅迫下能維持糖脂含量和組分穩(wěn)定的小麥品種具有更好的耐低氮能力[25]。小麥灌漿期旗葉衰老的過程中會伴隨著葉綠體、類囊體膜及葉綠素的降解和葉片功能的喪失, 但是尚不清楚低氮脅迫下膜脂組成的變化特征, 及膜脂與低氮誘導葉片衰老的關系。本試驗觀測了不同氮肥水平下灌漿期小麥旗葉葉綠素含量及光合能力、含氮量、膜脂及其組分變化, 以及類囊體蛋白質的堆積密度, 旨在分析葉片衰老與膜脂的關系, 探討低氮誘導葉片衰老的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗地位于中國科學院長武黃土高原農業(yè)生態(tài)試驗站(107°42′N, 107°40′E, 海拔1220 m)。該地年均溫9.1℃, ≥10℃積溫2994℃, 無霜期171 d; 年均降水量580 mm, 7月至9月降水量占全年總量的55%以上, 小麥生育期有效降雨量215.8 mm; 地下水位50~80 m。試驗地土壤為中壤質黑壚土, 含有機質8.7 g kg-1、硝態(tài)氮9.8 mg kg-1、銨態(tài)氮11.1 mg kg-1、速效磷16.3 mg kg-1。

供試小麥品種為長旱58。采用完全隨機區(qū)組設計, 設置正常氮(180 kg hm-2, 高產推薦用量)和低氮(120 kg hm-2) 2個氮處理, 每個處理3次重復, 小區(qū)面積為60 m2, 行距為20 cm。對所有小區(qū)基施P2O5120 kg hm-2。2015年9月28日播種, 2016年6月23日收獲, 在小麥開花當天(第0天)選擇開花一致的麥穗掛牌標記, 花后第14天, 取每小區(qū)30株旗葉, 一半冷凍在液氮中, 用于測定葉綠素和膜脂組成等指標, 另一半于105℃下烘30 min, 80℃下烘至恒重, 用于測定總氮含量等指標。

1.2 凈光合速率和葉綠素含量的測定

于每次采樣當天9:00—12:00, 用Li-6400便攜式光合儀(Li-Cor, USA)測定待采葉片的凈光合速率。在每個小區(qū)重復測定2個葉片, 取平均值為一個重復。每個處理3個小區(qū)即試驗為3個重復。

將旗葉樣品去除葉脈后剪成碎片, 稱取0.2 g采用丙酮浸提比色法[26]測定葉綠素含量。在每小區(qū)重復測定2次, 取平均值為一個重復。每個處理3個小區(qū)即試驗為3個重復。

1.3 葉片總氮含量測定

取不同處理條件下花后不同天數的小麥旗葉, 于105℃烘30 min, 80°C烘至恒重。采用凱氏定氮法測定葉片總氮含量。在每小區(qū)重復測定2次, 取平均值為一個重復, 每個處理3個小區(qū)即試驗為3個重復。

1.4 葉片膜脂的提取、分離及脂肪酸含量測定

取不同處理條件下花后第14天的小麥旗葉, 剪碎后稱取0.5 g, 按Wang和Benning[27]描述的方法提取葉片膜脂, 每處理3次重復(3個小區(qū)), 每小區(qū)1次重復。將提取的膜脂用薄層色譜(TLC)分離, 以十五烷酸(C15:0)作為內標, 采用島津GC2014C氣相色譜儀測定膜脂含量和膜脂脂肪酸組成。色譜柱為InertCap WAX (Cat. No. 1010-67162), 氣化室溫度250°C, 色譜柱溫度140.0°C, 設置柱溫箱梯度溫度為: 140~160°C, 25°C min-1; 160~240°C, 8°C min-1。色譜柱流量為1.00 mL min-1, 分流比為20.0∶1。

1.5 不飽和脂肪酸雙鍵指數的計算

根據Rawyler和Harwood等[28-29]描述的方法計算不飽和脂肪酸雙鍵指數(double-bond index, DBI), DBI = ∑[N×P]/100, N是指每個脂肪酸分子的雙鍵數, P為脂肪酸物質的量百分比。即

DBI = (0×P16:0+1×P16:1+2×P16:2+3×P16:3+0×P18:0+ 1×P18:1+2×P18:2+3×P18:3)/100。

1.6 統計分析

采用SPSS19.0軟件統計分析數據, 用Tukey’s HSD法進行單因素方差分析, 顯著性水平為0.05。用Microsoft Excel繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 低氮脅迫3對小麥旗葉凈光合速率和葉綠素含量的影響

與開花當天相比, 花后第14天正常氮處理的旗葉凈光合速率和葉綠素含量下降幅度不大, 分別為6%和2%, 而低氮處理則大幅下降30%和37% (圖1), 說明低氮脅迫降低了旗葉的光合能力, 加速了花后葉綠素降解和旗葉衰老。

2.2 低氮脅迫對小麥葉片總氮含量的影響

開花當天, 低氮處理葉片總氮含量比正常氮處理低24%, 到花后第14天, 處理間差異擴大到41%; 花后第14天正常氮處理的葉片總氮含量比開花當天降低10%, 而低氮處理花后第14天的葉片總氮含量則降低30% (圖2-A)。在兩種氮水平下, 2個生育期的總氮/葉綠素比值沒有顯著差異(圖2-B), 說明單位葉綠素氮含量不受氮水平的影響, 葉片總氮含量高時葉綠素含量也高, 反之亦然, 低氮脅迫會造成葉綠素含量下降。

圖1 低氮脅迫對小麥葉片凈光合速率和葉綠素含量的影響

柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示處理間差異顯著(< 0.05)。

Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference among treatments (< 0.05).

圖2 低氮脅迫對小麥葉片總氮含量和總氮/葉綠素的影響

柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示兩處理差異顯著(< 0.05)。

Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference among treatments (< 0.05).

2.3 低氮脅迫對小麥葉片膜脂含量和DGDG/ MGDG的影響

和正常氮處理比, 花后第14天時低氮處理的旗葉MGDG、DGDG、磷脂和總脂含量分別下降36%、32%、42%和37% (圖3-A), 表明低氮脅迫對旗葉中半乳糖脂和磷脂含量有影響, 低氮可能抑制膜脂合成或者加速膜脂降解。低氮脅迫后小麥葉片中的DGDG/MGDG比值顯著升高(圖3-B), 說明葉片在應對逆境脅迫時通過調節(jié)MGDG和DGDG含量比例, 進而重塑膜脂來維持生物膜在逆境條件下的生理功能。

圖3 低氮脅迫對小麥葉片膜脂含量(A)和DGDG/MGDG (B)的影響

MGDG: 單半乳糖甘油二酯; DGDG: 雙半乳糖甘油二酯; PL: 磷脂。柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示NN和LN兩處理間差異顯著(< 0.05)。

MGDG: monogalactosyldiacylglycerol; DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PL: phospholipid. Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference between NN and LN treatments (< 0.05).

2.4 低氮脅迫對小麥葉片膜脂主要脂肪酸的影響

小麥旗葉膜脂中脂肪酸的主要成分是C18:3不飽和脂肪酸。進一步分析膜脂不同組分的脂肪酸成分, 磷脂與糖脂存在明顯差異, 糖脂中C16:0、C16:1、C18:2和C18:3脂肪酸比例依次是10%、2%、3%和85%, 而磷脂中上述成分的比例分別是24%、7%、4%、12%和53%。低氮脅迫后, 小麥葉片中的MGDG、DGDG以及磷脂的不飽和脂肪酸(以C18:2和C18:3為主)含量顯著下降, 飽和脂肪酸(以C16:0為主)含量顯著升高(圖4), 影響了膜的結構和流動性。

2.5 低氮脅迫對小麥葉片膜脂雙鍵指數的影響

低氮脅迫后, 小麥旗葉中MGDG、PL和總脂的DBI顯著下降, 但是DGDG的DBI無顯著變化(圖5), 說明低氮脅迫對DGDG的影響較其他種類的膜脂弱。

圖4 低氮脅迫對小麥葉片中膜脂主要脂肪酸組分的影響

A: 單半乳糖甘油二酯的脂肪酸組分; B: 雙半乳糖甘油二酯的脂肪酸組分; C: 磷脂的脂肪酸組分; D: 總膜脂的脂肪酸組分。柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示不同脂肪酸組分間差異顯著(< 0.05)。

A: fatty acid compositions of monogalactosyldiacylglycerol; DGDG: fatty acid compositions of digalactosyldiacylglycerol; PL: fatty acid compositions of phospholipid; D: fatty acid compositions of total lipids. Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference among fatty acid compositions (< 0.05).

圖5 低氮脅迫對小麥葉片中膜脂雙鍵指數的影響

DBI: 雙鍵指數; MGDG: 單半乳糖甘油二酯; DGDG: 雙半乳糖甘油二酯; PL: 磷脂。柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示NN和LN兩處理間差異顯著(< 0.05)。

DBI: double-bond index; MGDG: monogalactosyldiacylglycerol; DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PL: phospholipid. Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference between the NN and LN treatments (< 0.05).

2.6 低氮脅迫對小麥葉片類囊體蛋白質堆積密度的影響

低氮脅迫后小麥葉片中MGDG/葉綠素、DGDG/葉綠素、PL/葉綠素以及總脂/葉綠素的比值均顯著升高(圖6)。類囊體蛋白質堆積密度的顯著降低, 影響了小麥旗葉的光合系統、運輸系統等結構, 從而使類囊體的生理功能受到嚴重破壞。

3 討論

葉綠素含量既是衡量葉片光合能力的常用參數, 也是葉片衰老的重要監(jiān)測指標。氮素水平與小麥生育后期旗葉衰老有密切關系, 低氮處理葉片比正常氮處理葉片更早衰老, 并且后期的衰老進程也更快[30]。本試驗觀察到花后第14天, 低氮處理旗葉的葉綠素含量和凈光合速率均顯著下降, 且旗葉明顯失綠發(fā)黃。說明旗葉早衰。本試驗氮處理后旗葉總氮含量顯著降低, 但是總氮/葉綠素值無顯著差異, 這與前人試驗結果[31-33]一致, 說明低氮脅迫促使小麥灌漿期旗葉早衰, 加重了葉片的衰老。

低氮處理后擬南芥角果在衰老過程中膜脂發(fā)生了降解, 并將降解產物轉移到種子中用于儲藏脂三酰甘油的合成, 說明低氮脅迫導致膜脂含量及組分變化[34]。MGDG與DGDG在結構上有較大差異, DGDG為雙層膜脂, MGDG為非雙層膜脂, 且MGDG為DGDG的合成底物[35]。膜脂中MGDG和DGDG的含量以及DGDG/MGDG的比例會影響生物膜的結構和功能。Gasulla等[36]比較了耐旱植物(和) 和干旱敏感植物(和擬南芥)在干燥及復水過程中膜脂組成的變化, 以及膜脂合成基因表達情況, 發(fā)現干旱脅迫下耐旱植物中總脂含量維持穩(wěn)定, 但是膜脂的組成發(fā)生了較大的變化, 最主要的變化是約50%的MGDG水解, 其中一部分水解成DAG用來合成磷脂, 另一部分則通過DGD1/DGD2途徑合成DGDG, 隨后通過SFR2形成寡聚半乳糖酯, 這些合成的磷脂和DGDG以及寡聚半乳糖酯均用于穩(wěn)定質膜及亞細胞器膜。本研究表明, 低氮處理導致的早衰葉片中MGDG、DGDG、PL和總脂的含量均顯著下降, 但是DGDG/MGDG的比值卻顯著升高, 這是因為低氮脅迫促使膜脂降解, 但是作為DGDG的合成底物, MGDG部分轉化為DGDG, 而DGDG的雙分子層結構會部分補償磷脂雙分子層的損傷, 對膜進行重塑, 有助于在最大程度上維持膜穩(wěn)定。同時膜脂脂肪酸比例也發(fā)生了變化, 其中不飽和脂肪酸(C18:2和C18:3)含量顯著下降, 而飽和脂肪酸(C16:0)含量顯著上升, 反映出膜的流動性受到損傷。分析膜脂DBI, 發(fā)現低氮脅迫下MGDG、DGDG、磷脂以及總脂的DBI均顯著下降, 說明膜的流動性和通透性受到破壞。以上結果表明, 低氮脅迫導致小麥旗葉中膜脂降解, 膜的流動性和通透性受到損傷, 影響了小麥旗葉的正常生理功能。

圖6 低氮脅迫對小麥葉片中膜脂與葉綠素含量比值的影響

MGDG: 單半乳糖甘油二酯; DGDG: 雙半乳糖甘油二酯; PL: 磷脂。柱圖顯示平均值±標準誤(= 3), 其上不同字母表示NN和LN兩處理間差異顯著(< 0.05)。

MGDG: monogalactosyldiacylglycerol; DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PL: phospholipid. Columns represent mean ± SE (= 3) and different letters above columns mean significant difference between NN and LN treatments (< 0.05).

類囊體是植物光合作用的主要場所, 幾乎所有的光合蛋白復合體均與葉綠素結合在類囊體膜上。類囊體膜主要由糖脂(MGDG和DGDG)組成, 因此, 糖脂/葉綠素的比值很好地反映出類囊體上光合蛋白的堆疊密度[37]。糖脂與葉綠素的比值越高表明蛋白質的堆積密度越低[38]。胡鋒等[39]研究發(fā)現, 低氮脅迫時擬南芥光合能力下降的同時伴隨著MGDG/葉綠素和DGDG/葉綠素的顯著增加, 表明缺氮時類囊體中光合蛋白的堆積密度有下降的趨勢。在本試驗中, 低氮處理旗葉花后第14天MGDG/葉綠素比值、DGDG/葉綠素比值以及總脂/葉綠素比值顯著增加, 說明低氮脅迫降低了小麥旗葉類囊體中光合蛋白的堆積密度。這不僅影響類囊體的結構, 而且影響光合蛋白復合體的生理功能, 從而使光合作用受到負面影響, 進一步加速了葉片的衰老。

4 結論

低氮脅迫下小麥灌漿期旗葉衰老伴隨著膜脂含量的降低和不飽和脂肪酸雙鍵指數降低, 膜脂降解, 膜的流動性和通透性遭到破壞; 與此同時蛋白質堆積密度降低, 葉綠素含量降低, 導致類囊體膜的結構和功能受損, 使葉片的光合功能破壞, 引起早衰。MGDG向DGDG的轉化是生物膜應對低氮脅迫的響應表現之一, 通過DGDG的雙層結構部分補償膜的損傷, 維持膜的結構和功能。

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Relationship between Lipid and Flag Leaf Senescence Induced by Low Nitrogen Stress during Grain Filling of Wheat

LI Qian1,2, QI Ling-Yun3,4, YIN Li-Na1,2,3,4,*, WANG Shi-Wen1,2,3,4, and DENG Xi-Ping1,2,4

1College of Natural Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;2State Key Laboratory of Soil Erosion and Dryland Farming on the Loess Plateau / Institute of Soil and Water Conservation, Chinese Academy of Sciences and Ministry of Water Resource, Yangling 712100, Shaanxi, China;3Institute of Soil and Water Conservation, College of Life Science, Northwest A&F University, Yang-ling 712100, Shaanxi, China;4College of Natural Resources and Environment, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Nitrogen (N) deficiency induces flag leaf senescence at the grain-filling stage of wheat resulting in yield decrease. In this study, we carried out a field experiment to investigate the relationship between N-deficiency-induced flag leaf senescence and lipid change using wheat variety ‘Changhan 58’. Under the low-N (120 kg ha–1) condition, the photosynthetic rate, chlorophyll content, total N content, and contents of all lipid components of flag leaf at 14 days after flowering were significantly lower than those under normal-N (180 kg ha–1) condition, while the DGDG/MGDG ratio in low-N treatment increased. The content of unsaturated fatty acids, such as C18:3 and C18:2 decreased significantly, whereas the contents of saturated fatty acids, such as C16:0, increased significantly, leading to the reduction of index of unsaturated double bounds. In addition, thylakoid protein packing density also decreased under N-deficiency condition. These results indicate that N-deficiency-induced leaf senescence is characterized with lipid degradation and components changes, which result in negative effects on reductions of membrane permeability, chlorophyll content and photosynthetic rate. Simultaneously, the DGDG/MGDG ratio of plants is adjusted in response to N deficiency to alleviate damages of membrane function caused bby lipid degradation.

wheat; flag leaf; nitrogen deficiency; membrane lipids; senescence

本研究由國家自然科學基金項目(31200206), 國家科技支撐計劃項目(2015BAD22B01), 陜西省科技新星項目(2016KJXX-66)和中國科學院青年創(chuàng)新促進會項目(2015389)資助。

This study was funded by the National Natural Science Foundation of China (31200206), the National Key Technology R&D Program of China (2015BAD22B01), the Program for Scientific and Technological Star of Shaanxi Province (2016KJXX-66), and the Youth Innovation Promotion Association of the Chinese Academy of Sciences (2015389).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180511.1037.002.html

2018-04-11;

2018-05-14.

10.3724/SP.J.1006.2018.01221

殷俐娜, E-mail:linayin@nwsuaf.edu.cn

E-mail: liqian515@mails.ucas.edu.cn

2017-11-09;