曹家蕊，王 冰，李方巍，張 燕*

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，北京 100083）

綠色果蔬加工過程中的顏色劣變是影響綠色果蔬原料商品化增值的主要問題，也是食品科學與工程領(lǐng)域研究的重要科學問題[1-2]。綠色是由存在于植物類囊體上的葉綠素蛋白復合體呈現(xiàn)的。加工過程中，類囊體膜破損、葉綠素蛋白復合體降解，形成的游離葉綠素進一步降解，導致了加工產(chǎn)品的顏色劣變和品質(zhì)下降[3-5]。長久以來一直沒有有效的策略控制加工綠色果蔬顏色的劣變。

pH值是加工過程中影響葉綠素降解的主要因素之一，低pH值下葉綠素能夠迅速脫鎂形成脫鎂葉綠素，使果蔬顏色由鮮綠色變成橄欖綠，且隨著酸性的增強，破壞性增強；而高pH值下葉綠素則會發(fā)生皂化水解反應(yīng)，生成鮮綠色的穩(wěn)定化合物[6-7]。因此，部分加工技術(shù)和工藝通過調(diào)節(jié)環(huán)境pH值對果蔬進行護綠[8-9]，使葉綠素在中性或偏堿性條件下形成皂化物，延遲脫鎂葉綠素的形成[10-13]。此方法在加工初期有一定效果，但在貯藏過程中，保護作用逐漸降低[14]。綜上所述，這些研究仍然關(guān)注于葉綠素的降解。

樊昶昶等[15]采用微量差示掃描量熱儀研究了梯度升溫下菠菜和油菜類囊體膜的變化，發(fā)現(xiàn)熱處理改變了類囊體膜上多肽、蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，不利于葉綠素的保持；并且熱處理后仍有大部分葉綠素以葉綠素蛋白復合體的形式存在。同時，該研究還證明了油菜類囊體膜的熱穩(wěn)定性優(yōu)于菠菜類囊體膜。

pH值作為加工過程中影響顏色變化和葉綠素降解的重要因素，其對類囊體膜，尤其是葉綠素蛋白復合體穩(wěn)定性的影響鮮有研究?；诖耍緦嶒炓圆げ撕陀筒藶檠芯繉ο?，分析不同pH值對熱處理后類囊體膜穩(wěn)定性的影響，包括類囊體膜的色度值、多肽組分、可溶性蛋白含量、類囊體膜吸收光譜以及葉綠素的倒置熒光顯像。分析熱處理后，pH值對類囊體膜及葉綠素蛋白復合體的影響，為找到葉綠素降解的控制策略提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜和油菜均購于中國農(nóng)業(yè)大學東校區(qū)家屬院果蔬市場。

蔗糖、氯化鈉、聚乙二醇4000、氫氧化鈉、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸緩沖液（pH 7.2～7.4） 北京索萊寶生物科技有限公司；所有溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Color Quest型色差儀 美國HunterLab公司；JY04S-3C型凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；UV-probe型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Nikon ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡 北京恒三江儀器銷售有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類囊體膜的提取

參考蘆然[16]、王蓉蓉[17]的方法，將新鮮菠菜洗凈后置于4 ℃冷庫中進行預冷處理，大約1 h后取預冷葉片進行類囊體膜的提取。每40 g葉片加入200 mL預冷的提取液（0.1 mol/L蔗糖，0.2 mol/L氯化鈉，50 mmol/L磷酸緩沖液，2.5%聚乙二醇4000，pH 7.4），家用高速勻漿器勻漿約1 min至無明顯綠色碎片，勻漿液經(jīng)8 層紗布過濾，濾液立即在4 ℃、3 000×g離心5 min，收集沉淀。將沉淀用10 倍體積的預冷清洗液（同提取液，不包含聚乙二醇4000）進行懸浮，4 ℃、3 000×g離心5 min，收集沉淀。將沉淀繼續(xù)用5 倍體積的預冷清洗液進行懸浮，4 ℃、500×g離心2 min，收集上層懸浮液。將懸浮液在4 ℃、3 000×g離心10 min，收集沉淀。將沉淀用懸浮液（0.31 mol/L蔗糖，50 mmol/L氯化鈉，50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 6.9）進行懸浮，即可得到類囊體膜制備液，該溶液可貯藏于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 類囊體膜的處理

將5 份盛有95 mL類囊體膜制備液的100 mL錐形瓶置于水浴鍋中，進行熱處理，待膜體系中心溫度達到90 ℃時，計時熱燙90 s，取出后將其在冰水中迅速冷卻。參考蔣將[18]的方法并略作修改，將熱燙后的類囊體膜制備液（初始pH 6.9）分別用2 mol/L HCl溶液滴定至pH 3.6、4.6、5.8，或者用2 mol/L NaOH溶液滴定至pH 6.9、7.5，并置于不同pH值（3.6、4.6、5.8、6.9、7.5）、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，分別在處理期0、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48 h和72 h，隨機抽取樣品。

1.3.3 表觀色值測定

采用Color Quest型色差儀對待測樣品進行分析，選擇反射模式進行測定，得到a*（紅-綠值）。

1.3.4 類囊體膜多肽組分測定

參考韋司棋[19]的方法略加修改，向60 μL類囊體膜溶液加15 μL 5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液（含二硫蘇糖醇）渦旋混勻，經(jīng)高溫變性、離心后，取上清液進行點樣，再加電極緩沖液，取出膠放在水中10 min，而后放入配制好的染色液中，在搖床上振蕩染色約12 h，水洗2～3 次，再加入脫色液脫色約12 h。采用凝膠成像系統(tǒng)進行攝影。

1.3.5 類囊體膜可溶性蛋白含量測定

取100 μL類囊體膜溶液，加入900 μL磷酸鹽緩沖液，經(jīng)振蕩混勻、離心后，取上清液，用于可溶性蛋白測定。采用Lowry法蛋白濃度測定試劑盒測定2 種蔬菜的類囊體膜中可溶性蛋白質(zhì)含量。采用分光光度計法分析。

1.3.6 類囊體膜吸收光譜測定

使用島津UV-probe紫外可見分光光度計對類囊體膜吸收光譜進行測定。取100 μL類囊體膜溶液，加到2 mL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液（含0.3 mol/L蔗糖，0.01 mol/L KCl）中，1 200×g離心5 min后取上清液，在室溫條件下測定波長400～720 nm的吸收光譜。

1.3.7 倒置熒光顯微鏡觀察

在避光環(huán)境中，取5 μL類囊體膜懸浮液，制成玻片。使用熒光光源，選擇DAPI濾光塊，以藍光激發(fā)葉綠素發(fā)出綠色熒光，采集葉綠素熒光圖片。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖形分析

應(yīng)用SPSS statisics 17的方差分析（ANOVA）對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著；應(yīng)用Origin Pro 8.6統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并制圖；應(yīng)用Image J對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對熱處理后類囊體膜表觀色值的影響

圖1 pH值對類囊體膜的-a*值的影響Fig. 1 Effects of pH on -a* value of thylakoid membrane

如圖1所示，放置期間，菠菜和油菜類囊體膜在不同pH值條件下，-a*值均顯著降低（P＜0.05），pH 3.6、4.6條件下-a*值下降速率較快。-a*值與葉綠素呈色相關(guān)，葉綠素大量損失造成-a*顯著下降，這與刁恩杰[20]、楊慧[21]等的研究結(jié)果一致。37 ℃放置72 h后，與菠菜相比，油菜類囊體膜的-a*值保留率較高，表明油菜類囊體膜能夠更好地保持蔬菜色澤。

低pH值會使類囊體膜中的游離葉綠素迅速脫鎂，形成黃褐色脫鎂葉綠素，影響食品色澤[22]。而低pH值是否會破壞葉綠素蛋白復合體，進而破壞結(jié)合態(tài)葉綠素，仍需進一步分析不同pH值條件下，類囊體膜多肽組分的變化。

2.2 pH值對熱處理后類囊體膜中多肽組分的影響

圖2 pH值對類囊體膜多肽組分的影響Fig. 2 Effects of pH on soluble polypeptide composition of thylakoid membrane

每個光系統(tǒng)II核心復合體（CP43、CP47和D1、D2）外周，結(jié)合了主要捕光復合物LHC II三聚體，以及分子質(zhì)量分別為29 kDa和26 kDa的次要捕光復合物CP29和CP26，CP29和CP26有助于光系統(tǒng)II蛋白復合體的蛋白質(zhì)聚合和穩(wěn)定[23]。由圖2可知，第0小時，在pH 3.6、4.6條件下，菠菜和油菜光系統(tǒng)II的主要捕光復合物LHC II三聚體所在條帶灰度顯著降低，菠菜和油菜類囊體膜光系統(tǒng)I的核心蛋白Psa A/B只是輕微降低。說明相對于光系統(tǒng)I蛋白復合體，光系統(tǒng)II蛋白復合體對低pH值更敏感。隨著放置時間的延長，Psa A和Psa B、LHC II以及CP29條帶逐漸模糊，表明葉綠素蛋白復合體逐漸被破壞。

菠菜和油菜類囊體膜多肽組成及各組分比例存在較大差異，且菠菜的類囊體膜多肽組分種類較油菜豐富。重要的是，多肽組分及功能的保持對于維持色素蛋白復合物中葉綠素的穩(wěn)定性、抑制其降解具有積極影響[15]，因此低pH值對葉綠素蛋白復合體造成的破壞不利于葉綠素的保持。

圖3 pH值對類囊體膜蛋白條帶灰度值的影響Fig. 3 Effects of pH on the gray level of protein bands in thylakoid membrane

如圖3所示，分別設(shè)第0小時菠菜和油菜類囊體膜pH 6.9下的蛋白條帶灰度值為1。在菠菜中，第0小時，低pH值（3.6、4.6）及高pH值（5.8、7.5）對應(yīng)樣品的灰度值分別為0.75～0.8和0.9～1；第72小時，pH 3.6、4.6對應(yīng)樣品的灰度值降至0.3～0.4，pH 5.8、6.9、7.5的蛋白條帶灰度值降至0.5左右。而在油菜處理組中，第0小時，pH 3.6、4.6對應(yīng)樣品的灰度值約為0.5～0.6，pH 5.8、7.5的灰度值約為0.7～1；37 ℃放置72 h后，油菜類囊體膜不同pH值條件下樣品的灰度值降低至0.4～0.6之間。

菠菜和油菜在較低pH值（3.6、4.6）下類囊體膜多肽組分顯著降解，說明酸性環(huán)境（pH 3.6、4.6）能迅速破壞類囊體膜中的葉綠素蛋白復合體。由此推論，酸性環(huán)境不僅能破壞游離葉綠素，而且會破壞綠色蔬菜的葉綠素蛋白復合體，使大量葉綠素暴露在高濃度H＋環(huán)境，進而使得葉綠素在H＋的作用下，迅速脫鎂降解。

2.3 pH值對熱處理后類囊體膜可溶性蛋白含量的影響

圖4 pH值對類囊體膜放置期間可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effects of pH on soluble protein content in thylakoid membrane during storage

圖4 為37 ℃放置期間，熱處理后的菠菜和油菜類囊體膜可溶性蛋白隨pH值和時間的變化，各處理組變化趨勢基本一致。第0小時，pH 3.6、4.6條件下的菠菜和油菜類囊體膜可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05）?？扇苄缘鞍讌⑴c類囊體膜的構(gòu)建、葉綠素蛋白復合物的組成、類囊體膜結(jié)構(gòu)和理化特性的保持以及色素的穩(wěn)定。因此較高的可溶性蛋白含量能夠維持類囊體膜的功能活性，進而維持較高的光反應(yīng)活性[24-25]。pH值能夠影響酸性氨基酸和堿性氨基酸的解離狀態(tài)，影響次級鍵的穩(wěn)定[26]，由此推測，pH值較低時，可溶性蛋白空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而降低蛋白溶解度。不同pH值條件下類囊體膜可溶性蛋白的變化進一步表明低pH值在一定程度上降低了葉綠素蛋白復合物的穩(wěn)定性，促使葉綠素降解。第72小時，菠菜類囊體膜可溶性蛋白含量顯著上升（P＜0.05），而放置期間，油菜可溶性蛋白含量變化不顯著（P＞0.05）。菠菜和油菜可溶性蛋白含量變化的不同，可能是由其植物學生理結(jié)構(gòu)的差異導致的。葉綠素蛋白復合體結(jié)構(gòu)不同，菠菜和油菜類囊體膜光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的組成比例也可能存在較大差異，因此其對pH值的響應(yīng)不同[27]。

2.4 pH值對熱處理后類囊體膜吸收光譜的影響

圖5為熱燙后類囊體膜光吸收特性隨pH值的變化。吸收峰強度的高低代表類囊體膜捕光能力大小，熱處理后菠菜和油菜類囊體膜的吸收峰分別在441 nm和675 nm左右，這兩個吸收峰主要對應(yīng)于葉綠素a的吸收峰，而熱處理后菠菜和油菜葉綠素b和類胡蘿卜素對應(yīng)的474 nm左右的吸收峰消失。

圖5 pH值對類囊體膜吸收光譜特性的影響Fig. 5 Effects of pH on spectral absorption characteristics of thylakoid membrane

如圖5所示，放置期間，不同pH值下類囊體膜各吸收峰強度均呈現(xiàn)下降趨勢。在菠菜處理組中，在第0小時，pH 3.6、4.6條件下類囊體膜吸收峰強度下降顯著，尤其在pH 3.6時，特征吸收峰消失；37 ℃放置72 h后，不同pH值下樣品的特征吸收峰基本消失。在第0小時，油菜類囊體膜在pH 3.6、4.6條件下，樣品藍區(qū)的吸收峰變化明顯；37 ℃放置72 h后，油菜類囊體膜在pH 3.6、4.6、5.8的特征吸收峰消失。

類囊體膜上的葉綠素以結(jié)合態(tài)的形式與膜上特殊的蛋白質(zhì)相結(jié)合，當部分葉綠素從類囊體膜中游離出來，即由結(jié)合態(tài)葉綠素變成游離態(tài)葉綠素時，共軛雙鍵被破壞，類囊體膜吸收光譜會由長波向短波方向移動，即發(fā)生藍移[28-29]。由此推測，菠菜和油菜類囊體膜特征吸收峰的消失是由低pH值破壞類囊體結(jié)構(gòu)造成的，進而破壞游離葉綠素，從而影響類囊體膜體系中葉綠素吸收光能的能力。同時，低pH值（3.6、4.6）對菠菜類囊體膜的破壞程度高于油菜類囊體膜，進一步說明菠菜類囊體膜對pH值的敏感性高于油菜類囊體膜。有研究表明，低pH值（5.5）會導致類囊體膜中光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II之間能量的重新分配[30]。本實驗中油菜吸收峰的變化可能也與能量重新分配有關(guān)，但仍需進一步研究。

2.5 類囊體膜的熒光倒置顯微鏡成像

圖6 不同pH值處理后類囊體膜倒置熒光顯微鏡圖Fig. 6 IFM images of thylakoid membrane after pH offset processing

圖6 為熒光倒置顯微鏡下呈現(xiàn)的類囊體膜葉綠素熒光分布，隨pH值降低，類囊體膜葉綠素熒光分布由松散變聚集，熒光區(qū)域逐漸不規(guī)則化，且低pH值（3.6、4.6）條件下類囊體膜更易產(chǎn)生分層現(xiàn)象。由此證實，低pH值可改變類囊體膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當pH值由5.5降低到4.0時，類囊體會發(fā)生皺縮[31]，這一結(jié)果與本實驗結(jié)論較為一致。還可觀察到，相同條件下，菠菜類囊體膜的熒光密度與油菜相比更高，葉綠素熒光亮斑更大，熒光強度更大，這與菠菜的基粒片層、葉綠素蛋白復合體及葉綠素含量均比油菜多有關(guān)。37 ℃處理72 h后，低pH值（3.6、4.6）的菠菜類囊體膜葉綠素熒光基本消失，而油菜對應(yīng)組葉綠素熒光依然存在。因此，與油菜類囊體膜相比，菠菜類囊體膜對低pH值的敏感性更高。

3 結(jié) 論

與高pH值（5.8、6.9、7.5）相比，低pH值（3.6、4.6）條件下菠菜和油菜類囊體膜溶液-a*值顯著降低，葉綠素蛋白復合體的多肽組分明顯降解，可溶性蛋白含量顯著降低，熒光分布發(fā)生聚集。由此說明，低pH值（3.6、4.6）能夠破壞類囊體膜及葉綠素蛋白復合體的結(jié)構(gòu)、功能穩(wěn)定性，使更多葉綠素游離出來，從而加速葉綠素降解；相同pH值條件下，菠菜類囊體膜穩(wěn)定性低于油菜類囊體膜；相對于光系統(tǒng)I葉綠素蛋白復合體，光系統(tǒng)II葉綠素蛋白復合體對低pH值更敏感。該研究對于加工過程中葉綠素的降解控制具有重要的理論意義。