洪子茜，楊秋萍，侯馨怡，鄧 鴿，張 立，費(fèi)雪婷，胡又文，雍 彬，邵歡歡

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

植物蛋白酶抑制劑(protease inhibitors， PIs)是一類分子量較小的蛋白或多肽，PI可以與蛋白酶的變構(gòu)部位或活性區(qū)域結(jié)合從而抑制蛋白酶活性，因此可以抑制食草類昆蟲消化道中蛋白酶的活性，降低昆蟲對(duì)植物的攝食量，影響昆蟲的生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至可以導(dǎo)致昆蟲的死亡，是參與植物防御機(jī)制的重要成分之一。PI在調(diào)節(jié)蛋白酶的活性以及蛋白質(zhì)的代謝方面有著難以代替的作用，是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在植物儲(chǔ)存淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官（如塊莖、種子、球莖等）中，PI含量甚至高達(dá)總蛋白的10%。目前通過現(xiàn)代分子分離技術(shù)已經(jīng)從50多種植物材料獲得蛋白酶抑制劑，其中以植物種子含量最多和最廣泛。半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibtor，CPI）是PI中的一類重要的蛋白酶抑制劑，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，能夠參與生命體內(nèi)的多種生理生化反應(yīng)，與巰基蛋白水解酶形成動(dòng)態(tài)平衡。CPI參與調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng)，在植物的種子萌發(fā)、胚體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞程序性死亡、防治蟲害、果實(shí)成熟等方面具有重要的作用。此外，近年來有研究也發(fā)現(xiàn)CPI在植物抗逆脅迫方面也發(fā)揮了重要的作用，如，擬南芥中存在的兩種半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）基因AtCYSa和AtCYSh在逆境環(huán)境下，如低溫、干旱、鹽、氧化脅迫下可以被誘導(dǎo)表達(dá)，且在酵母中過表達(dá)能提升酵母在脅迫環(huán)境下抗低溫、鹽、干旱、氧化脅迫能力。麻風(fēng)樹的JcCPI基因在大腸桿菌和煙草中進(jìn)行異源過表達(dá)也可以提升其耐鹽能力，而且轉(zhuǎn)基因煙草中丙二醛含量更低，抗過氧化酶活力更高，這表明CPI可以通過影響過氧化物酶活性來降低非生物脅迫引起的次生氧化脅迫，最終提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性和適應(yīng)能力。目前，已經(jīng)從擬南芥、玉米、番茄、麻風(fēng)樹、小麥等50多種植物中克隆得到了CPI基因，研究發(fā)現(xiàn)CPI蛋白在植物種子中的含量較多，CPI蛋白的序列保守性也非常強(qiáng)，而甘薯中的CPI蛋白目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究采用RT-PCR從甘薯嫩葉組織中克隆得到CPI基因，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21對(duì)其抗逆能力進(jìn)行了初步探索，使用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行了分析，為未來深入研究甘薯CPI基因的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在自然條件下從大田中采集徐薯18的根、莖、葉等組織，采集后即清洗擦干，短期凍存在液氮中?？寺∷拗骶辏捍竽c桿菌DH5ɑ，表達(dá)菌株大腸桿菌BL21，原核表達(dá)載體是pET-32a(+)。

1.1.1 主要工具酶與試劑 RNA提取所用Trizol及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen 公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶KOD-FX-Neo 酶購(gòu)東洋紡公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自TAKARA公司，引物及測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與RT-PCR 以徐薯18（四川省農(nóng)科院生核所提供）各種組織為材料，液氮冷凍后用研缽磨碎成粉末后立刻使用Trizol進(jìn)行總RNA提取，提取得到的RNA進(jìn)行等比例混勻，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后取1μg RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有方法均按照Invitrogen 公司試劑盒的推薦方法完成。

1.2.2 甘薯CPI基因克隆及載體構(gòu)建 以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，IbCPI-F：5'-CG GGATCCATGGCTTTGGGAGGCGTTAC-3'和IbCPI-R：5'-CCCAAGCTTTTAAACACTGA CACTAGAGATGCCA-3'為引物，使用KODPlus-Neo（1 U/μL）高保真酶進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘，98℃變性10秒，56℃退火5秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，純化后的PCR產(chǎn)物及pET-32a(+)載體分別使用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后使用T4DNA連接酶在16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選4個(gè)陽性克隆并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 序列分析 根據(jù)甘薯CPI基因測(cè)序結(jié)果，使用BLAST和DNAman軟件進(jìn)行基因及蛋白序列同源比對(duì)，利用ProtParam分析IbCPI蛋白的理化性質(zhì)包括：相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)(pI)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等，使用NPS@和Swiss-model進(jìn)行IbCPI蛋白的二級(jí)和三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)分析，利用TMpred、Wolf psort、NetPhos 3.1、SignalP 4.1 Server等軟件分別進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)肽等分析，使用MEGA5.0對(duì)其他10個(gè)物種的CPI蛋白與甘薯CPI蛋白進(jìn)行聚類分析，將甘薯CPI蛋白提交至STRING分析能與甘薯CPI蛋白發(fā)生互作的潛在蛋白。

1.2.4 重組菌株的脅迫處理 將重組菌和對(duì)照菌株（空載體）分別置于2mL LB（含有50μg/mL Amp）液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將其接入10mL液體LB中當(dāng)OD600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。取此培養(yǎng)液分別移入含有Amp的LB培養(yǎng)基和30%PEG6000的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩培養(yǎng)，分別進(jìn)行無脅迫培養(yǎng)和干旱脅迫；另取培養(yǎng)液接入含有Amp的LB培養(yǎng)基中放置于45℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，對(duì)重組菌株進(jìn)行高溫脅迫。對(duì)無脅迫培養(yǎng)每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣及利用紫外分光光度儀測(cè)定OD600值，對(duì)脅迫培養(yǎng)每隔4h取樣并測(cè)定OD600值，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，最終繪制生長(zhǎng)曲線。

圖1 CPI基因PCR產(chǎn)物電泳圖M：DL5000 Maker；1：以甘薯CPI基因PCR產(chǎn)物Fig.1 Agarose electrophoresis analysis of IbCPI RT-PCR productsM：DL5000 Maker；lane 1： IbCPI gene PCR product of sweet potato

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建

以提取得到的徐薯18嫩葉總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在350bp左右出現(xiàn)一明顯條帶，大小與預(yù)期片段大小基本一致，PCR產(chǎn)物膠回收后與pET-32a(+)載體分別進(jìn)行BamHI和HindIII雙酶切，使用DNA連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性克隆PCR驗(yàn)證后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 IbCPI蛋白質(zhì)序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示甘薯CPI基因長(zhǎng)度為345bp，其翻譯的蛋白長(zhǎng)度為114aa，使用Protparam軟件、對(duì)甘薯CPI蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，甘薯CPI蛋白分子式為C564H894N142O176S1，分子量為12.51 kDa，理論等電點(diǎn)4.83，不穩(wěn)定系數(shù)是30.59，因此是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，脂肪系數(shù)為89.74，親水性值為-0.302，因此甘薯CPI是一個(gè)親水性蛋白。通過BLAST軟件搜尋與IbCPI蛋白同源序列，甘薯CPI蛋白與Ipomoea nil、Ziziphus jujuba、Jatropha curcas、Sesamum indicum的CPI蛋白的序列相似度分別是86.96%、58.26%、55.65%、55.65%。C P I蛋白具有非常保守的活性位點(diǎn)區(qū)域，甘薯CPI蛋白也具有類似的保守序列，在其第48-52位氨基酸含有活性位點(diǎn)基序Q-X-V-XG(Q48-V49-V50-A51-G52)。

圖2 IbCPI與其他植物CPI全長(zhǎng)蛋白序列比對(duì)Fig.2 Alignment of IbCPI with cystatins from other plant speciesbased on the full-length amino acid sequence.

2.3 IbCPI蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

使用TMpred軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)甘薯CPI沒有明顯的跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘薯CPI蛋白可能沒有信號(hào)肽，因此可能是一種胞內(nèi)蛋白，亞細(xì)胞定位軟件Wolf psort對(duì)甘薯CPI蛋白在甘薯細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K最近鄰(k-Nearest Neighbor，KNN)值為14，其中8個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)中，3個(gè)位于葉綠體中，3個(gè)位于胞外，即甘薯CPI定位可能性為：細(xì)胞質(zhì)＞葉綠體＞胞外。NetPhos 3.1分析結(jié)果表明甘薯CPI蛋白可能具有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中有2個(gè)Serine位點(diǎn)（Pos13、Pos18），1個(gè)Threonine位點(diǎn)（Pos7），3個(gè)Tyrosine位點(diǎn)（Pos8、Pos19、Pos23），這表明IbCPI可能可能受多種蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化所調(diào)控， 參與各種細(xì)胞調(diào)控過程。

2.3.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用NPS@軟件對(duì)IbCPI蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中α-螺旋有24個(gè)（21.05%）氨基酸，β-折疊有34個(gè)（29.82%）氨基酸，無規(guī)則卷曲有54個(gè)（47.37%）氨基酸，模糊狀態(tài)有2個(gè)（1.75%）氨基酸。利用 Swiss Model數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了甘薯CPI蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索得到最適模板4tx4.1.B（Cysteine proteinase inhibitor of Vigna unguiculata），其序列相似度為67.47%，可以作為模板進(jìn)行同源建模，得到甘薯CPI蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（如圖3所示）。

圖3 IbCPI的三維結(jié)構(gòu)Fig.3Three-dimensional structure of IbCPI

2.3.2 蛋白互作分析 使用STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，以Solanum lycopersicum的CPI蛋白為模板構(gòu)建甘薯CPI的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，篩選最小相互作用分值為0.4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與5個(gè)相關(guān)蛋白（TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1）可以發(fā)生相互作用（如圖4所示），但是這些相互作用的具體調(diào)控模式目前尚不清楚。

圖4 甘薯CPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Protein-protein interaction analysis of IbCPI

2.4 進(jìn)化樹分析

進(jìn)化樹分析是使用MEGA5.0軟件的鄰接歸并法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建，bootstrap 自檢重復(fù)1000次。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast 軟件將甘薯CPI基因編碼的氨基酸序列與GenBank中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和相似性搜索。結(jié)果表明，克隆得到的甘薯CPI蛋白與Ipomoea nil的CPI蛋白的親緣關(guān)系最近，這與甘薯的物種分類情況也較為一致。

圖5 甘薯CPI蛋白進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree of IbCPI

2.5 重組菌對(duì)脅迫的耐受性研究

2.5.1 無脅迫生長(zhǎng) 由圖6可知，在無脅迫條件下，含有IbCPI基因的菌體與對(duì)照菌株（含有空載體）的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，這表明過表達(dá)IbCPI基因?qū)Υ竽c桿菌的生長(zhǎng)幾乎沒有影響。

2.5.2 干旱脅迫 使用30%PEG6000對(duì)大腸桿菌進(jìn)行干旱脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7）含有目的基因的重組菌株的遲滯期在20小時(shí)左右，而對(duì)照菌株則為32小時(shí)，而且相比對(duì)照菌株，重組菌株的生長(zhǎng)更具優(yōu)勢(shì)，過表達(dá)IbCPI有利于大腸桿菌菌株在干旱脅迫下生長(zhǎng)。

2.5.3 高溫脅迫 將重組菌株和對(duì)照菌株均在45℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行高溫脅迫，由圖8可以看出，相比無脅迫對(duì)照菌株和重組菌株在高溫脅迫下生長(zhǎng)速度都明顯下降，但是含有甘薯CPI基因的菌株生長(zhǎng)效果明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，這表明過表達(dá)甘薯CPI基因有助于提升大腸桿菌的耐高溫能力。

圖8 重組菌在45℃的LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curves of recombinant bacteria in LB medium at 45℃

3 討論

甘薯又名甜薯，旋花科植物，屬喜光的短日照作物，是世界第六大糧食作物，在我國(guó)為第四大糧食作物，淀粉含量高、產(chǎn)量高、應(yīng)用前景廣闊。隨著當(dāng)前自然環(huán)境的惡化，各種非生物脅迫如干旱、鹽、堿以及重金屬等環(huán)境壓力的增加日益影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，但甘薯表現(xiàn)出了其特有的抗逆特性，能夠一定程度上地抵御外界環(huán)境帶來的生存壓力。因此，對(duì)甘薯相關(guān)抗逆基因的研究，對(duì)作物的抗脅迫性質(zhì)能力的改善，以及對(duì)提高經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量有著重要的意義。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑是重要的組織防御應(yīng)激蛋白，同時(shí)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)，在植物的抗逆脅迫中也起到了重要的作用。本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆得到甘薯全長(zhǎng)CPI基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IbCPI蛋白也具有保守的 Q-X-V-X-G(Q48-V49-V50-A51-G52)結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他CPI蛋白類似都具有3個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，IbCPI蛋白可能與TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1等蛋白能夠發(fā)生作用，但是目前的作用機(jī)制尚不清楚。將IbCPI基因插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的過表達(dá)，在高溫和干旱脅迫下發(fā)現(xiàn)重組菌株比對(duì)照菌株具有更短的遲滯期且生長(zhǎng)效果更佳，這表明IbCPI基因可能具有提升細(xì)胞的抗逆脅迫的能力，這為未來深入研究IbCPI基因的功能及提升甘薯的產(chǎn)量具有一定的意義。