張景霞 霍雪寒 王芙蓉 張傳云 張軍

摘要：Bax inhibitor-1（BI-1）是調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（endoplasmic reticulum stress， ER stress）介導的細胞死亡的關(guān)鍵因子，在植物耐逆中具有重要作用。目前，棉花BI-1（GhBI-1）的耐逆功能及其調(diào)控細胞死亡的相關(guān)報道較少。在本研究中，采用ER stress專一性誘導毒素——衣霉素（tunicamycin，TM）對棉花幼苗進行脅迫處理，實時定量PCR結(jié)果表明，GhBI-1的TM誘導表達具有組織特異性，根GhBI-1對TM的響應更加強烈。通過TM抗性試驗及細胞死亡的分析發(fā)現(xiàn)，GhBI-1的表達提高了擬南芥的TM抗性，減緩了ER stress介導的細胞死亡。此外，未折疊蛋白反應信號通路中的bZip60轉(zhuǎn)錄因子基因的表達受GhBI-1的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：Bax inhibitor-1；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫；細胞死亡；棉花；擬南芥；衣霉素

中圖分類號：S562.01文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0001-06

Abstract Bax inhibitor-1 （BI-1） regulates cell death mediated by endoplasmic reticulum stress （ER stress）， and plays important roles in plant stress tolerance. Up to now， the role of cotton BI-1 （GhBI-1） involved in stress tolerance and cell death remain largely unknown. In the present study， we characterized the expression patterns of GhBI-1 under ER stress conditions induced by tunicamycin（TM）. The results of real-time quantitative PCRs showed that the inducible expression pattern of GhBI-1 was tissue specific. The expression of GhBI-1 in roots is stronger compared with in leaves under ER stress conditions. The overexpression of GhBI-1 increased the TM resistance of transgenic Arabidopsis and delayed cell death mediated by ER stress. The analysis of the expression of bZip60 involved in unfolded protein response showed that GhBI-1 activated the avtivity of bZip60 and improved cell tolerance to ER stress.

Keywords Bax inhibitor-1； Endoplasmic reticulum stress； Cell death； Cotton； Arabidopsis； Tunicamycin

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是膜蛋白和分泌蛋白合成新肽鏈及進行新肽鏈初步折疊的重要場所。許多不利的環(huán)境和生理條件都會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白的正常折疊，導致未折疊和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（endoplasmic reticulum stress， ER stress）[1]。在短期且較溫和的ER stress脅迫下，未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）調(diào)控下游分子伴侶及脅迫基因的表達，恢復未折疊蛋白進行正確折疊，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動態(tài)平衡；而在持續(xù)且強烈的ER stress脅迫下，UPR觸發(fā)“死亡信號”，使細胞不可逆地發(fā)生程序性細胞死亡（programmed cell death， PCD）[2-4]。PCD是高度保守的受基因控制的重要細胞事件，參與真核細胞的發(fā)育、脅迫應答等過程[5]。PCD的發(fā)生需要極其精細的調(diào)控，在眾多的調(diào)控因子中，Bax inhibitor-1（BI-1）是抑制細胞死亡發(fā)生的關(guān)鍵因子[6]。

BI-1是動植物及真菌中普遍存在且高度保守的細胞死亡抑制因子之一。Xu等最早從人cDNA文庫中分離出BI-1基因，BI-1的表達能夠阻斷由鼠Bax誘發(fā)的細胞死亡[7]。在腫瘤細胞系中，過表達人BI-1能夠增強細胞對脅迫刺激的耐受性；相反，降低BI-1的表達加速細胞死亡。動物細胞中BI-1調(diào)控PCD的機制已解析的比較清楚，在ER stress發(fā)生時，BI-1受UPR信號支路IRE1a的調(diào)控表達，通過其C末端尾及跨膜區(qū)形成離子通道，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中駐留的Ca2+信號的流動，從而抑制死亡，促進細胞生存[8-10]。

與動物BI-1的研究相比，植物BI-1的研究相對滯后，但進展迅速。目前，已從大麥、辣椒、水稻、擬南芥等植物中分離出BI-1同源基因[11-14]。植物BI-1在不同的組織（葉片、根、莖、花、果實等）中都有表達；在ER stress專一性誘導劑——衣霉素（tunicamycin，TM）誘導下高水平表達，說明植物BI-1可能在緩解ER stress造成的危害中具有重要功能[3]。植物BI-1還具有與動物類似的跨膜結(jié)構(gòu)域，暗示其可能具有與動物BI-1相似的功能，也參與了ER stress誘發(fā)的細胞死亡的調(diào)控[14，15]。Watanabe等對擬南芥BI-1基因（AtBI-1）缺失的擬南芥突變體（atbi1-1，T-DNA插入敲除突變體）的研究拓寬了人們對BI-1調(diào)控ER stress介導的細胞死亡的認識。AtBI-1的缺失使atbi1-1對ER stress更加敏感，加速了PCD的發(fā)生；而過表達AtBI-1提高了擬南芥對ER stress的耐受能力，ER stress介導的PCD相應延遲[3]。此外，缺失C端的AtBI-1蛋白不具備調(diào)節(jié)細胞死亡的功能，說明其帶有成簇電荷的C末端是其正常行使功能所必需的結(jié)構(gòu)[8]。

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物和戰(zhàn)略資源儲備，同時也是鹽堿地“先鋒作物”，其全生長期都面臨不利的環(huán)境條件。較強的脅迫對棉花生長造成惡劣影響，產(chǎn)量減少、品質(zhì)降低，嚴重時甚至導致棉株死亡。因此，深入研究棉花適應及抵御逆境的機制，提高棉花對逆境的適應能力，對惡劣條件下棉花生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。前期工作中，我們對棉花BI-1（GhBI-1）進行了克隆及功能分析，揭示了GhBI-1在植物耐鹽中的重要作用[16]。但到目前為止，GhBI-1在ER stress誘發(fā)的細胞死亡中的作用尚未見報道。本試驗以前期工作為基礎，擬分析ER stress下的GhBI-1響應模式。通過評估過表達GhBI-1對轉(zhuǎn)基因擬南芥的ER stress耐受能力及細胞死亡的影響，分析GhBI-1在ER stress及細胞死亡中所起的作用，為進一步研究GhBI-1的抗逆功能及機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

過表達棉花Bax inhibitor-1（GhBI-1）及野生型擬南芥（Columbia ecotype）由本實驗室鄭玲及霍雪寒同學提供[16，17]。試驗所用陸地棉品種為Coker 312。

棉花總RNA的提取使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司）；擬南芥總RNA抽提使用Trizol試劑盒（上海生工）；反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑購自TaKaRa；衣霉素（tunicamycin， TM）、臺盼藍試劑購自上海生工。

1.2 棉花GhBI-1基因的TM誘導表達分析

用質(zhì)量濃度為10 μg/mL的TM溶液處理二葉期棉花幼苗，處理時間為0、4、12、18、24 h。取葉片及根用液氮速凍，-70℃凍存。采用華越洋多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，用基因特異性引物（GhBI-1-F/R， 表1）進行qRT-PCR。PCR程序為95℃ 5 min； 95℃ 5 s， 60℃ 10 s， 72℃ 10 s， 40個循環(huán)。使用Applied Biosystems進行試驗和分析。GhBI-1的相對表達量用2-△△Ct方法計算，誤差線表示SD（n=3）。

1.3 轉(zhuǎn)GhBI-1基因擬南芥的半定量PCR鑒定

轉(zhuǎn)GhBI-1基因擬南芥的獲得見霍雪寒等[16]的方法。轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合后代由本實驗室保存。本試驗使用其中3個獨立轉(zhuǎn)化系，分別為OE1、OE2、OE3。轉(zhuǎn)基因擬南芥播種后置于溫室培養(yǎng)，25 d后利用Trizol法提取葉片總RNA，利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以此為模板，利用基因特異引物（GhBI-1-F/R）進行半定量PCR。

1.4 TM脅迫下的擬南芥萌發(fā)率分析

將WT和OE系的種子用1%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，分別播種在含有0、0.1、0.3 μg/mL TM的MS培養(yǎng)基上，4℃放置3 d后移至光照培養(yǎng)箱中，7 d后統(tǒng)計種子萌發(fā)率。誤差線表示SD（n=3）。

1.5 擬南芥幼苗期的TM抗性分析

WT和OE系種子進行表面滅菌，播種在MS培養(yǎng)基上。當子葉平展且側(cè)根尚未長出時（10 d），將其轉(zhuǎn)移到含有0、0.5 μg/mL TM的固體MS培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)，3周后稱量幼苗鮮重，統(tǒng)計測量側(cè)根數(shù)目及長度。誤差線表示SD（n=3）。

1.6 細胞死亡檢測

將苗齡30 d的擬南芥植株的葉片浸泡在2 μg/mL TM溶液中進行暗處理，3 d后將葉片取出，用無菌水沖洗后利用臺盼藍染色法進行細胞死亡檢測。將處理后的葉片置于乳酸酚（乳酸、甘油、苯酚、滅菌水等體積混勻）配制的含0.25 mg/mL臺盼藍的染色液中，煮半分鐘；冷卻后，用脫色液（95%乙醇∶乳酸酚=2∶1）脫色10 min[18]。同時，提取同樣處理的0、6 h的葉片總RNA，用qRT-PCR法檢測bZip60的相對表達量（方法同1.2，所用引物為bZip60-F/R， 表1）。用2-△△Ct方法計算bZip60的相對表達量，誤差線表示SD（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhBI-1基因的TM誘導表達特性

棉花幼苗經(jīng)TM處理后，利用qRT-PCR檢測葉片及根中GhBI-1的誘導表達情況（圖1），結(jié)果顯示，GhBI-1受TM誘導上調(diào)表達。與葉GhBI-1的表達相比，根GhBI-1對TM的響應更加強烈。處理12 h后，根GhBI-1的表達量達到最高，為處理前的30倍；此時，葉GhBI-1的表達量為處理前的6.7倍。隨著處理時間的延長，根和葉GhBI-1的表達量逐漸回落。上述結(jié)果說明GhBI-1響應TM脅迫，在TM誘導下強烈表達。此外，GhBI-1的誘導表達具有組織特異性，根GhBI-1對TM的響應更加強烈。

2.2 過表達GhBI-1提高擬南芥萌發(fā)期的TM抗性

首先，利用半定量PCR檢測過表達GhBI-1擬南芥（OE1、OE2、OE3）中GhBI-1的表達情況，結(jié)果（圖2）顯示，所檢測的3個獨立轉(zhuǎn)化系均能夠擴增出GhBI-1基因的特異性條帶，而野生型對照中未檢測到，該結(jié)果說明GhBI-1能夠在擬南芥中表達。

為研究GhBI-1的功能，分析了過表達GhBI-1對種子萌發(fā)率的影響。結(jié)果（圖3）顯示，與脅迫處理前相比，TM處理后的WT和OE系的種子萌發(fā)率均降低，說明TM脅迫抑制了種子萌發(fā)。不同濃度TM處理下，OE系的萌發(fā)率均較WT高。在0.1 μg/mL TM脅迫下，WT的種子萌發(fā)率降為79.3%，OE系的萌發(fā)率為92.0%～94.0%；在0.3 μg/mL TM脅迫下，OE系的萌發(fā)率為69.3%～73.0%，為WT萌發(fā)率（41.3%）的1.68～1.76倍。上述結(jié)果說明過表達GhBI-1基因提高了擬南芥種子萌發(fā)期對TM脅迫的抵抗能力。

2.3 過表達GhBI-1提高擬南芥幼苗期的TM抗性

為進一步研究GhBI-1的功能，進行了苗期TM抗性試驗（圖4）。將苗齡相同、生長一致的WT和OE系幼苗（苗齡為10 d）轉(zhuǎn)移到含有0.5 μg/mL TM的MS固體培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)，21 d后觀察拍照并對鮮重、側(cè)根數(shù)及伸長進行測定。結(jié)果顯示（圖4A），幼苗在TM脅迫下出現(xiàn)葉片卷曲、失綠等脅迫表型。與WT相比，OE系的脅迫表型相對較輕。

對脅迫后的幼苗鮮重進行稱量，結(jié)果顯示（圖4B），在正常的MS培養(yǎng)基上生長時，WT和OE系幼苗的鮮重基本一致；附加TM后，OE系幼苗的鮮重高于WT，約為WT鮮重的1.6倍。此外，對TM脅迫后幼苗側(cè)根的數(shù)目和長度進行統(tǒng)計測量。在未進行TM處理時，WT和OE系的側(cè)根數(shù)和長度基本一致，沒有顯著差別；TM處理后，OE系的側(cè)根發(fā)生較WT多，約為WT的2倍（圖4C）。相應地，側(cè)根長度也呈現(xiàn)出相似的趨勢。未進行TM處理時，WT和OE系的側(cè)根長度均為120 mm左右，沒有明顯的差別；TM處理后，OE系的側(cè)根長度約為WT的2.5倍（圖4D）。上述結(jié)果說明，過表達GhBI-1提高了擬南芥幼苗期的TM抗性。

2.4 過表達GhBI-1抑制ER-stress誘導的細胞死亡

為研究GhBI-1提高TM抗性的機制，檢測了TM脅迫后的細胞死亡情況以及bZip60的表達情況。結(jié)果（圖5）顯示，TM處理后，WT和OE系葉片均有不同程度的染色，TM處理造成ER stress誘發(fā)細胞死亡。與WT相比，OE系葉片的臺盼藍染色面積較小，相對分散，染色較淺。此外，利用qRT-PCR檢測了bZip60的表達變化。結(jié)果（圖6）顯示，TM處理前，bZip60的表達水平較低，TM脅迫6 h后，bZip60的表達水平顯著提高。與WT相比，OE系中bZip60的表達水平較高。處理6 h時，OE系中bZip60的表達量約提高了6.9倍，而WT中bZip60的表達量提高了2.3倍。以上結(jié)果表明，GhBI-1激活了UPR信號通路關(guān)鍵基因bZip60的表達，減輕了TM引起的ER stress，減緩了細胞死亡的發(fā)生。

3 討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)參與生命代謝、信號傳遞、生長發(fā)育等各個方面，其合成、折疊、轉(zhuǎn)運需要精確的調(diào)控。新肽鏈的折疊及修飾非常復雜，極易受到細胞環(huán)境的影響[19，20]。任何環(huán)境脅迫和生理脅迫都有可能導致新肽鏈的錯誤折疊，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，造成ER stress。ER stress激活UPR反應， 啟動分子伴侶及脅迫相關(guān)基因的表達，幫助細胞應對脅迫環(huán)境。目前，ER stress及UPR的相關(guān)研究逐漸成為植物耐逆領域的熱點問題。

TM是一種蛋白質(zhì)N-糖基化作用抑制劑，目前被廣泛應用在ER stress相關(guān)的研究中[21-23]。本試驗利用TM對棉花幼苗進行處理，分析GhBI-1對TM誘導的響應情況。GhBI-1受TM誘導表達，但在根和葉中的響應模式不同。根GhBI-1基因的TM誘導表達非常強烈，處理12 h時，表達量高達處理前的30倍。葉GhBI-1對TM的響應較弱，處理12 h時，表達量為處理前的6.7倍（最高值），說明GhBI-1的誘導表達在不同組織中有差異。此外，擬南芥TM抗性檢測也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，OE系根對TM抗性的提高較為明顯。Ruberti等的研究結(jié)果也表明，AtBI-1對bZip28轉(zhuǎn)錄因子活性的影響在根和葉中不同[21]。

當ER stress持續(xù)發(fā)生時，UPR不僅誘導脅迫基因及分子伴侶基因的表達，幫助未折疊或錯誤折疊蛋白進行折疊，同時，還能發(fā)出“促死亡”信號，誘發(fā)細胞死亡[24，25]，例如，擬南芥的根在TM持續(xù)脅迫時會發(fā)生PCD [6，26]。AtBI-1沉默后，突變體對TM的敏感性提高，更易發(fā)生細胞死亡。在本研究中，我們在利用TM長時間處理擬南芥葉片后發(fā)現(xiàn)，長期的ER stress誘發(fā)葉片細胞發(fā)生死亡。GhBI-1的過表達抑制了細胞死亡的發(fā)生，這與AtBI-1的報道是一致的，GhBI-1可能具有與AtBI-1相似的抗細胞死亡的功能。

植物UPR主要有2條信號通路，一條是由bZip28轉(zhuǎn)錄因子介導的通路，另一條由bZip60轉(zhuǎn)錄因子介導的通路[27，28]。在持續(xù)ER stress下，擬南芥bZip28和bZip60的雙突變體是致死的[29]，說明bZip28/bZip60的活性在“促生存”信號通路中具有極其重要的作用。在本研究中，持續(xù)的ER stress 條件下，過表達GhBI-1使擬南芥對ER stress的耐受性提高，細胞死亡減緩，同時，bZip60的表達水平提高，推測GhBI-1可能是通過激活bZip60信號通路，減緩了ER stress介導的細胞死亡。綜上，GhBI-1受TM誘導表達，且其表達具有組織特異性。過表達GhBI-1提高擬南芥的TM抗性，緩解ER stress造成的毒害，推遲細胞死亡的發(fā)生，說明GhBI-1具有抑制ER stress介導的細胞死亡的功能。

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