李穎秀 李臻 潘教文 王慶國 劉煒

摘要：類受體蛋白激酶（receptor-like kinase， RLKs）是植物信號分子的受體，它能夠通過胞內(nèi)激酶域?qū)Φ孜镞M行磷酸化或去磷酸化，從而對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達進行調(diào)控，參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，在植物生長發(fā)育及環(huán)境應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。本研究以水稻“中花11”cDNA為模板，通過PCR技術(shù)獲得類受體蛋白激酶基因FTPK1的全長序列，進一步構(gòu)建原核表達載體pET-28a-FTPK1后，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導12 h，獲得88 kD的誘導表達蛋白條帶，顯示FTPK1可在大腸桿菌中誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化及透析后，獲得純化的融合蛋白。FTPK1激酶活力檢測顯示，其可磷酸化蛋白底物His和MBP，具有一定的磷酸化活性。本研究為進一步制備FTPK1特異性抗體，深入解析其理化特性及生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；類受體蛋白激酶；FTPK1；原核表達；蛋白純化；激酶活力檢測

中圖分類號：S511.0353文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）05-0007-07

Abstract Receptor-like protein kinases （RLKs） are receptors of signaling molecules of plants. It can be phosphorylated or dephosphorylated through the intracellular kinase domain， thus regulating the transcription and expression of downstream target gene， participating in the intracellular signal transduction， and playing a role in plant growth and environmental response. In this study， the cDNA of rice variety Zhonghua 11 was used as template to obtain the full-length sequence of FTPK1 gene by PCR， and the pET-28a-FTPK1 prokaryotic expression vector was constructed. An 88 kD fusion protein could be induced by 1 mmol/L IPTG for 12 hours， indicating that FTPK1 could be induced in E. coli. The purified protein product of FTPK1 could be obtained after purification and dialysis by Ni column. The detection of protein kinase activity showed that FTPK1 could phosphorylate the substrates of His and MBP， which showed that FTPK1 has phosphorylation activity. This research shed some lights for further preparation of the FTPK1 specific antibody， and lay solid foundation for analysis the physical and biochemical functions of FTPK1.

Keywords Rice； Receptor-like protein kinase； FTPK1； Prokaryotic expression； Protein purification； Kinase activity detection

所有生命體在細胞水平上都是通過各種受體接收和處理信息來維持機體的正常生命活動，這些受體不僅能夠識別來自環(huán)境和臨近細胞的信號，還能夠激活其下游的信號級聯(lián)途徑。在動物中，典型的一類受體是受體激酶（receptor kinases，RKs）。RKs有一個能夠?qū)Ｒ恍宰R別配基的胞外結(jié)構(gòu)域，其通過一個跨膜結(jié)構(gòu)域連接著一個胞內(nèi)激酶區(qū)。其激活過程依賴于磷酸化[1]。

植物類受體蛋白激酶（receptor-like kinases，RLKs）的結(jié)構(gòu)類似于動物RKs[2-4]。由一個胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個包含近膜區(qū)、激酶區(qū)和羧基端的胞內(nèi)域構(gòu)成，通過胞外區(qū)與胞外信號分子特異結(jié)合來激活胞內(nèi)激酶區(qū)的磷酸化，完成跨膜信號轉(zhuǎn)導的功能。研究證明大部分RLKs都能發(fā)生自體磷酸化，這對于它本身的功能具有極其重要的作用，例如，蕓苔屬SRK是自交不親和性受體，它是雌蕊一方的重要因子，只有當雌蕊和不親和性花粉進行相互識別，才能引發(fā)受體的自磷酸化[5]。生物化學分析方法揭示抗性蛋白Xa21的胞內(nèi)近膜區(qū)的絲氨酸686、蘇氨酸688和絲氨酸689均能發(fā)生自磷酸化，但用丙氨酸取代這些氨基酸后，可使Xa21蛋白不穩(wěn)定，從而弱化了Xa21介導的抗病性，但不影響激酶區(qū)的自磷酸化[6]。最近，有研究者發(fā)現(xiàn)Xa21近膜區(qū)的蘇氨酸75在Xa21的自磷酸化和先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，將其突變?yōu)楸彼岷?，則激酶區(qū)喪失了自磷酸化活性，Xa21的抗病功能明顯降低[7]。這些研究表明，激酶活性在類受體激酶行使生物學功能的過程中是必須的，植物RLKs的信號轉(zhuǎn)導過程與動物中激酶的轉(zhuǎn)導方式相似，均需借助于磷酸化與自磷酸化。

Pro-Q Diamond dye 是 Molecular Probes 公司開發(fā)的一種熒光染色試劑，主要用于信號轉(zhuǎn)導中蛋白磷酸化的研究，可以直接對磷酸化蛋白凝膠進行染色，檢測磷酸化位點中的酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸的磷酸化而無需加入抗體，同時該染料還與質(zhì)譜兼容，且不妨礙隨后蛋白質(zhì)組中多種磷酸化分析研究[8]。Pro-Q Diamond dye對于不同的磷酸化位點，靈敏度差異較大，對高豐度且磷酸基團轉(zhuǎn)化速率低的蛋白質(zhì)具有較高的靈敏度。Orsatti等[9]聯(lián)合運用二維電泳和 Pro-Q Diamond dye 染色方法，以過度表達蛋白酪氨酸磷酸酶 PRL-3 的高度侵襲性結(jié)腸癌細胞 HCT116 為模型，通過 Pro-Q Diamond dye 檢驗芯片，成功檢測出 PRL-3 的兩種目標蛋白——細胞骨架蛋白 ezrin 和延伸因子2 有明顯的去磷酸化。Liu等[10]應(yīng)用雙向凝膠電泳和 Pro-Q Diamond dye染色技術(shù)對人體張氏肝臟細胞總蛋白進行了分離，結(jié)果共鑒定出 269個磷酸化蛋白。據(jù)此，Liu等推測，雙向凝膠電泳結(jié)合 Pro-Q Diamond dye 染色方法可以檢測全部磷酸化蛋白。Ding等分析了運動對大鼠海馬區(qū)能量代謝和神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的影響[11]。Schulenberg等應(yīng)用蔗糖密度梯度分離和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，通過 Pro-Q Diamond dye分析了牛心臟線粒體蛋白磷酸化穩(wěn)態(tài)，成功得到肽質(zhì)量指紋圖譜，并能區(qū)分相同磷酸多肽不同亞型之間的磷酸化[12]。

本研究結(jié)合基因序列信息分離到一個水稻發(fā)育相關(guān)的類受體蛋白激酶，命名為Flower Time Protein Kinase 1（FTPK1），通過構(gòu)建水稻FTPK1基因的融合蛋白表達載體pET-28a-FTPK1，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中誘導蛋白表達，經(jīng)透析純化，對蛋白產(chǎn)物進行激酶活力檢測驗證其磷酸化活性。該研究有利于進一步解析激酶FTPK1的生理生化特性及生物學功能，為進一步完善類受體蛋白激酶的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以水稻“中花11”為材料。TransTaq DNA Polymerase High Fidelity （HiFi）試劑盒、T4 DNA Ligase試劑盒、2×EasyTaq Super Mix及Trans 2K Plus DNA Marker均購于Transgen公司（山東濟南雨同生物科技有限公司），PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、pMD18-T Vector試劑盒、pET-28a載體及DL5000 DNA Marker均購于TaKaRa公司，純質(zhì)粒小量制備試劑盒購于BioTeke公司（濟南承森貿(mào)易有限公司），薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于GENERAY Biotech，引物由上海英濰捷基公司合成，其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 水稻幼苗RNA的提取及單鏈cDNA的獲得

取培養(yǎng)2周的水稻幼苗，按TransZol Plant試劑盒說明書提供的方法提取水稻RNA，并參照PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將所得水稻RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。

1.3 FTPK1的克隆

根據(jù)FTPK1基因序列（NCBI登錄號：XM_015763263.1），使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物FTPK1S8：5′CCGGATCCATGCCGAAATCTAAATCATTCGTC3′，F(xiàn)TPK1A5：5′CCGTCGACGGTAAACAGGCGACAGGGACATGG3′（下劃線分別為BamHⅠ、 SalⅠ酶切位點），以水稻幼苗cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaq Super Mix 10 μL、引物FTPK1S8及引物FTPK1A5各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O補齊到20 μL。反應(yīng)程序設(shè)置如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.4 FTPK1原核表達載體的構(gòu)建

將經(jīng)PCR擴增得到的FTPK1片段回收純化，與pMD18-T載體用T4 DNA連接酶于22℃連接30 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，均勻涂于100 mg/L Amp抗性LB平板，于37℃倒置過夜培養(yǎng)。對構(gòu)建的中間表達載體，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后，送至山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心測序室測序。使用BamHⅠ、SalⅠ分別酶切測序正確的pMD18-T-FTPK1質(zhì)粒及原核表達載體pET-28a，回收純化酶切片段，用T4 DNA連接酶22℃連接30 min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，酶切檢測。選擇鑒定正確的pET-28a-FTPK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，均勻涂于100 mg/L Kan抗性LB平板37℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)PCR鑒定，獲得陽性菌株，鑒定為陰性的菌株為對照。

1.5 FTPK1融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化及SDS-PAGE鑒定

分別將含有重組質(zhì)粒pET-28a-FTPK1的BL21（DE3）菌株及陰性對照菌株于37℃振蕩培養(yǎng)，菌液按1∶50用液體LB培養(yǎng)基稀釋，培養(yǎng)至OD600≈0.6，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）于20℃培養(yǎng)箱誘導12 h，轉(zhuǎn)速分別為120、140、160 r/min。收集菌液經(jīng)超聲波破碎后，5 000 r/min離心10 min，分別取破碎菌液、上清、沉淀進行12% SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色、脫色后觀察并記錄。

1.6 FTPK1融合蛋白純化

根據(jù)優(yōu)化好的誘導條件，500 mL大量搖菌，蛋白經(jīng)IPTG誘導過夜后6 000 r/min離心10 min收集菌體。加入40 mL起始緩沖液重懸菌體，加入5 μg溶菌酶37℃水浴1 h，于-80℃放置至少1 h后30℃水浴解凍，超聲波破碎1 h（每10 s破碎一次，每次破碎5 s）后，9 000 r/min離心10 min，取上清用于蛋白純化。Ni-Trap柱與0.45 μm過濾器連接好，注射器取5 mL滅菌水注入鎳柱中緩慢排除柱內(nèi)乙醇，取3～5 mL 0.1 mol/L硫酸鎳注入柱中，用5 mL去離子水清洗掉未結(jié)合的鎳離子，然后用5 mL起始緩沖液洗柱平衡，將20 mL蛋白上清分次緩慢注入鎳柱，用5 mL起始緩沖液洗柱，再用8 mL沖洗緩沖液洗柱，最后用5 mL洗脫緩沖液溶解并洗脫目的蛋白，將蛋白洗脫液置于1.5 mL EP管中，每管約500 μL，棄第一管，共收集3管，放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 純化蛋白的透析及濃度檢測

配置1 L的透析液（50 mmol/L磷酸緩沖液、0.1 mmol/L EDTA、5 mmol/L β-巰基乙醇、5%甘油）于大燒杯中，放入含有上一步純化的蛋白的密封透析袋，使之跟隨轉(zhuǎn)子緩慢旋轉(zhuǎn)。期間每隔6 h更換一遍透析液，約20 h后透析完成，將透析好的蛋白吸取到1.5 mL EP管中，經(jīng)考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 熒光染色法檢驗蛋白的磷酸激酶活性

1.8.1 激酶反應(yīng) 激酶反應(yīng)體系為30 μL，每個反應(yīng)需2 μg蛋白，30℃反應(yīng)1 h。本試驗用150 μL的反應(yīng)體系，每個反應(yīng)用10 μg蛋白（表1）。設(shè)置5個反應(yīng)體系，所加蛋白種類及用量如表2所示，各反應(yīng)30℃放置1 h后加入600 μL甲醇，混勻后加入150 μL氯仿，12 000 r/min離心5 min；棄上清后加入450 μL甲醇，混勻后12 000 r/min離心5 min；棄上清后在真空干燥箱中放置10 min； 每管用40 μL 1× protein loading buffer回溶，開蓋煮沸5 min 后冰浴10 min，進行SDS-PAGE電泳。

1.8.2 凝膠染色 將蛋白膠置于100 mL固定液（甲醇100 mL、冰醋酸20 mL、超純水80 mL），40 min后更換固定液過夜，反應(yīng)均在50 r/min、28℃的培養(yǎng)箱進行；超純水清洗3次，每次加100 mL，每隔10 min換一次；將水倒掉，之后避光操作，加入100 mL Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain染劑，染色1.5 h；倒掉染色液，加入100 mL脫色液（乙腈200 mL、1 mol/L乙酸鈉50 mL、超純水750 mL），每隔30 min更換一次，共換3次；超純水100 mL沖洗兩次，每次5 min；凝膠成像儀觀察并記錄染色結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 FTPK1基因的克隆

借助PCR技術(shù)，擴增FTPK1基因，得到一條長2 343 bp的條帶，與預(yù)測基因大小一致，為目的條帶（圖1）。

2.2 FTPK1原核表達載體的構(gòu)建

使用BamHⅠ、SalⅠ雙酶切pMD18-T-FTPK1質(zhì)粒（圖2），回收純化FTPK1片段，定向連入pET-28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α菌株，酶切驗證，得到預(yù)期大小片段。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）進一步PCR鑒定，篩選陽性克隆（圖3），獲得FTPK1的原核表達載體pET-28a-FTPK1（圖4）。

2.3 FTPK1融合蛋白誘導表達

含有重組質(zhì)粒pET-28a-FTPK1的BL21（DE3）菌株經(jīng)1 mmol/L IPTG于20℃培養(yǎng)箱誘導12 h，轉(zhuǎn)速分別為120、140、160 r/min，超聲波破碎后經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳膠檢測，如圖5所示，與對照相比，在70～100 kD之間有一條特異的蛋白條帶，其大小與預(yù)測蛋白大小相吻合，約為88 kD。而且比較幾個不同轉(zhuǎn)速下誘導表達的蛋白條帶可知，在轉(zhuǎn)速為120 r/min時蛋白的表達量無論在上清還是沉淀中都是最高的，所以將1 mmol/L IPTG于120 r/min、20℃誘導12 h作為最佳誘導條件，用于之后蛋白的誘導純化過程。

M：Blue Plus Ⅱ Potein Marker；1、5分別為含pET-28a空載菌株120 r/min誘導12 h后的上清和沉淀；2—4、6—8分別為含pET-28a-FTPK1菌株120、140、160 r/min誘導12 h后的上清及沉淀。

2.4 FTPK1融合蛋白純化及透析

pET-28a質(zhì)粒上含有一個His標簽，融合蛋白pET-28a-FTPK1經(jīng)超聲波破碎后過Ni柱純化，含有His標簽的蛋白與氯化鎳結(jié)合，用含有咪唑的洗脫液洗脫，咪唑與蛋白爭奪結(jié)合位點，從而使蛋白洗脫下來。經(jīng)Ni柱純化的蛋白還會含有分子量小于目的蛋白的片段，經(jīng)透析液透析，最終得到約88 kD大小的與目的蛋白片段大小相近的蛋白產(chǎn)物 （圖6），保存于超低溫冰箱備用。

2.5 FTPK1融合蛋白磷酸激酶活性檢測

MBP和His是激酶的蛋白底物，若激酶與蛋白底物進行反應(yīng)后的熒光染色結(jié)果比自身強，則說明該激酶具有磷酸化活性，能夠磷酸化蛋白底物。如圖7所示，F(xiàn)TPK1融合蛋白與蛋白底物MBP、His進行激酶反應(yīng)后，經(jīng)熒光染料Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain染色，結(jié)果顯示與激酶反應(yīng)后的蛋白底物條帶與單獨的蛋白底物條帶相比有較明顯加深（右圖第2～5泳道下方條帶），這說明FTPK1融合蛋白具有磷酸化活性。

3 討論與結(jié)論

在動物中，受體激酶主要分為受體酪氨酸激酶和絲/蘇氨酸激酶[13]，其中，最被人熟知的絲/蘇氨酸激酶是轉(zhuǎn)化生長因子-β受體復(fù)合物，由兩個不同的受體形成的異構(gòu)復(fù)合物。Ⅱ型受體為能夠結(jié)合配基，促進Ⅰ型受體磷酸化。在Ⅱ型受體不存在時，Ⅰ型受體不能單獨結(jié)合配體。Ⅰ型受體磷酸化后能夠?qū)⑿盘栂蛳掠蝹鲗14]。受體酪氨酸激酶是通過配基激活同源二聚體或者由兩個相關(guān)的受體酪氨酸激酶形成的異源二聚體來發(fā)揮作用。激酶域的活化區(qū)自磷酸化激活自身激酶的活性，使得磷酸化的酪氨酸成為招募下游信號途徑組分的銜接位點，或者激活下游信號級聯(lián)途徑[15]。

目前，在植物中RLKs的功能尚不清楚，因其結(jié)構(gòu)與與動物RKs結(jié)構(gòu)類似，推測其在植物中也有類似功能。Trotochaud和Gmez-Gmez等對兩個受體的突變體進行分析，一個是參與頂端分生組織發(fā)育的CLV1，另一個是參與病原引起的防衛(wèi)反應(yīng)的FLS2，試驗證明突變后的CLV1和FLS2不能與各自的配基CLV3和鞭毛蛋白相互作用[16，17]，推測激酶自身具有磷酸化活性可能是該激酶能夠與其配基結(jié)合的必要條件 。

本研究利用pET系統(tǒng)構(gòu)建了FTPK1的原核表達載體pET-28a-FTPK1，參考實驗室前期研究[18，19]，分別經(jīng)不同濃度IPTG在不同溫度不同轉(zhuǎn)速的情況下誘導12 h后進行SDS-PAGE蛋白電泳，經(jīng)觀察比較，篩選到合適的蛋白誘導條件，即1 mmol/L IPTG于120 r/min、20℃培養(yǎng)箱誘導12 h。蛋白純化后凝膠檢測發(fā)現(xiàn)仍有兩條蛋白雜帶，猜測其原因可能有兩個，一是蛋白較大，在誘導過程中會合成不完整的蛋白片段，因其大小與目標蛋白相似且同樣帶有His標簽，所以在Ni柱純化時也會被結(jié)合并洗脫下來；第二個可能原因是與蛋白相互作用較強的蛋白因不易與其分離，也被洗脫下來。此外，觀察對比FTPK1的磷酸激酶活性檢測結(jié)果可知，底物MBP和His的確被其磷酸化而使熒光染料染色加深，但結(jié)果并不十分理想，猜測可能原因是設(shè)備條件及人為操作等因素在蛋白純化及透析過程中對蛋白造成的損傷較大，使蛋白活力受到一定影響，從而導致蛋白磷酸化活性下降。

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi)容，在酶和其它重要功能分子活性的發(fā)揮、第二信使傳遞和酶的級聯(lián)作用中起到重要的作用。蛋白質(zhì)的磷酸化主要集中在肽鏈中的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸殘基上，這些殘基上具有游離的羥基，且本身不帶電荷，當磷酸化作用后，蛋白質(zhì)便具有了電荷，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進一步引起蛋白質(zhì)活性的變化，這也是蛋白質(zhì)磷酸化的意義所在。本研究通過對FTPK1融合蛋白表達載體的構(gòu)建，蛋白誘導表達、純化及激酶活性檢測來驗證該激酶的磷酸化活性，為進一步研究該類激酶的功能奠定了基礎(chǔ)。

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