李羽翡，張德榮，劉 煜，吳霞明，王建軍，祖 新，段 鵬

(1甘肅省食品檢驗研究院，蘭州 730030；2西北民族大學甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，蘭州 730030)

諾如病毒是食源性疾病的主要病原之一，全球每年約有300萬人群感染諾如病毒。諾如病毒傳播途徑多樣，可通過糞口途徑傳播，也可通過攝入污染的食物和水，以及感染病人、物體或表面接觸傳染，并且環(huán)境抵抗力強、感染劑量低、傳染性強、傳播能力廣[1-6]。統(tǒng)計結(jié)果顯示，18個諾如病毒粒子就可以致病，抵抗力較弱的兒童、老人是該病毒的易感高危人群。諾如病毒極易在半封閉的場所內(nèi)爆發(fā)，容易造成群體性疫情。

近年來，諾如病毒感染事件越來越受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。我國已經(jīng)有多起諾如病毒聚集性暴發(fā)事件報道，但多是基于現(xiàn)場流行病學分析和病人的檢測數(shù)據(jù)，對污染源頭、污染量，尤其是對有關(guān)食品中諾如病毒監(jiān)測報道較少，部分研究數(shù)據(jù)只能借鑒國外相關(guān)報道[7-9]。

本文對蘭州地區(qū)可能被該病毒污染的食品如海鮮類(牡蠣、貽貝、蝦、海螺、扇貝)、生食水果(圣女果、草莓、藍莓)、蔬菜(生菜、乳瓜)等進行抽樣檢測、分析與數(shù)據(jù)匯總。對于掌握蘭州地區(qū)海鮮食品等諾如病毒的污染狀況、發(fā)現(xiàn)食品安全隱患以及評價食品經(jīng)營加工環(huán)節(jié)諾如病毒污染控制水平等提供基礎數(shù)據(jù)及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑盒采用Permerdesign Norovirus Genogroup 1 and 2 Genesig Easy Kit 2 Target Gene Kit，北京科奧明生物技術(shù)有限公司，配套使用oasig Lyophilised One Step QRT-PCR Mastermix 凍干型一步法qRT-PCR預混液。病毒RNA提取試劑盒(Roche High pure Viral RNA Kit)、蛋白酶K(Proteinase K，recombinant PCR Grade)，德國羅氏；諾如病毒陽性質(zhì)控球，中國食品藥品檢定研究院；果膠酶，美國Sigma；牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；磷酸鹽(PBS)緩沖液(gibco)，Life Technologies corporation；聚乙二醇(PEG8000)，上海生工生物工程股份有限公司；Tris鹽酸鹽(Vetec reagent grade，≥99%)，西格瑪；甘氨酸、氯化鈉(優(yōu)級純)，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ViiATM7實時熒光定量PCR儀(美國ABI)、MagNA Pure LC 2.0核酸提取儀(美國羅氏)、OPTI-MAIR生物安全柜(新加坡 ESCO)、MEGAFUGE8R高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾)、SIM-F140ADL制冰機(日本松下)、MAXQ420HP搖床(美國賽默飛世爾)、MS205DU電子天平(瑞士梅特勒)、電磨勻漿器、生物安全柜等。

1.3 樣品采集

于2017年6月—2018年3月期間采集市售貝類海鮮(包括生蠔、貽貝、扇貝、蝦、海螺等)、蔬菜水果(包括生菜、乳瓜、藍莓、草莓、圣女果等)共計120份(表1)，樣品采集原則：每個采樣點采集樣品不超過3件。以6～8個貝類樣品作為1件樣品，較小貝類，由于其消化腺也小，10～12件貝類作為1件樣品，最終保證每件樣品解剖后消化腺和腸道的總重量≥2.0g。蔬菜、水果樣品以1 000g為1份，采集的新鮮樣品應低溫保存，防止變質(zhì)。樣品送達實驗室后立即處理，若不及時處理，應冰箱保存，24h內(nèi)進行處理并檢測。

表1 樣品采集明細

1.4 方法

1.4.1樣品前處理

(1)貝類海鮮樣品：取5～10個貝類進行解剖，取其消化腺和腸道總質(zhì)量2.0g于15mL離心管，加入2mLPBS緩沖液、10μL濃度為20mg/mL蛋白酶K溶液，37℃，320r/min振蕩1h進行消化。然后恒溫水浴60℃，保持15min，后3 000g離心5min，取上清液200μL進行后續(xù)的RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒，操作過程按說明書進行。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體，作為外加擴增控制。

(2)蔬菜樣品：將新鮮菜葉剪至2cm2左右，直接稱取25g，放入帶有濾膜的無菌取樣袋內(nèi)，加入40mL TEBG (Tris/甘氨酸/牛肉膏)buffer，室溫搖晃20min，將均質(zhì)袋濾膜一側(cè)的液體全部轉(zhuǎn)移至1支50mL離心管，4℃條件下，10 000×g，離心30min。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，并加入1/4倍體積的5×PEG/NaCl溶液，4℃條件下?lián)u晃60min，并10 000×g，離心30min。離心結(jié)束，棄上清液，繼續(xù)4℃條件下，10 000×g，離心5min壓實沉淀。離心結(jié)束，向沉淀加入500μL PBS溶液溶解沉淀，進行后續(xù)的RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體。

(3)水果樣品：將水果樣品剪至2cm3左右的小塊，直接稱取25g，放入帶有濾膜的無菌取樣袋內(nèi)。加入30μ/mL的果膠酶溶液2mL，后續(xù)操作同蔬菜，然后進行RNA提取，提取過程采用High pure Viral RNA Kit試劑盒。樣品提取過程中均要加入過程控制病毒MS2噬菌體。

1.4.2RNA提取與純化 使用羅氏High pure Viral RNA Kit試劑盒，并嚴格按照試劑盒說明操作，提取物在-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在RNA的提取過程中，所有樣品均添加4μL外加擴增控制RNA(MS2噬菌體提取的RNA)。

1.4.3Real-time RT-PCR檢測

(1)反應體系的配制：選用GI和GII兩套引物探針體系分別進行擴增。反應總體系20μL，其中Mastermix 10μL，NOROVIRUS引物探針混合物1μL，過程控制病毒或外加擴增控制RNA引物探針混合物1μL、水3μL、模板RNA5μL。

(2)反應條件的設置：55℃，10 min(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃，2min(預變性)；95℃，10秒(變性)；60℃，60秒(數(shù)據(jù)采集)；其中變形、數(shù)據(jù)采集為50個循環(huán)。

1.4.4標準曲線的構(gòu)建 分別吸取90μL模板制備液到4個EP管中，標記為2～5；吸取10μL陽性對照到2號管，充分混勻；從2號管吸取10μL到3號管，充分混勻，依次重復上述步驟，完成梯度稀釋。1～5號管則濃度梯度分別為2×105/μL、2×104/μL、2×103/μL、2×102/μL、20/μL。擴增曲線如圖1所示。

圖1 標準物質(zhì)擴增溶解曲線

1.4.5結(jié)果的判斷 結(jié)合樣品Ct值、陽性對照、陰性對照、空白對照、過程控制病毒以及外加擴增控制RNA綜合判定結(jié)果(表2)，防止假陽性及假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝類海鮮中污染監(jiān)測

通過80份貝類海鮮樣品的擴增產(chǎn)物溶解曲線分析發(fā)現(xiàn)，5份陽性標本均為GII型，匯總結(jié)果顯示陽性樣品為生蠔和貽貝，且貽貝的檢出率高達20%(表3)。

圖2為實際樣品的擴增產(chǎn)物溶解曲線，對照標準曲線可以看出，陽性樣品濃度在2×102～20/μL之間。由于諾如病毒致病劑量較低，10～100個病毒即可致病，因此該濃度的陽性樣本足以引起一次諾如病毒感染事件。

表2 結(jié)果判讀依據(jù)

表3 120份樣品中諾如病毒檢測結(jié)果

圖2 實際樣品擴增產(chǎn)物溶解曲線

2.2 蔬菜水果中諾如病毒污染監(jiān)測

本實驗采集并檢測蔬菜、水果樣本共計40個，未檢測到陽性樣品。

3 討論

甘肅地處西北，食品中諾如病毒的檢測工作尚未開展，因此，掌握蘭州地區(qū)海鮮等食品中諾如病毒的污染情況及發(fā)展趨勢，確定危害分布因素和可能來源具有重要意義。本研究首次對蘭州地區(qū)貝類海鮮、蔬菜水果中的諾如病毒進行檢測篩查，為預測諾如病毒的污染狀況、了解食品安全狀況及發(fā)現(xiàn)食品安全隱患提供了科學依據(jù)。本實驗方法包含陽性對照模板，作為反應的對照及定量標準，利用陽性對照模板生成標準曲線，獲得Ct值。每次實驗均設置1個陽性對照，以證明實驗方案中的引物、探針設計合理；反應體系、程序執(zhí)行無誤。同時在加樣過程中，將陽性對照模板置于PCR加樣室，在加完待測樣品、空白對照并密封后再加入陽性對照模板，可利于避免陽性對照模板造成交叉污染。每次檢測實驗均設置空白對照，以水為模板，以保證所測陽性樣品的真實有效，反應體系未受污染。為證明提取實驗基于的生物樣本為有效樣本，選取大腸桿菌內(nèi)源基因設計引物，探針進行提取擴增；若內(nèi)源基因信號較弱，指示原始樣本未含有足夠的生物成分。使用MS2噬菌體過程控制病毒以及外加擴增控制MS2RNA作為核酸提取實驗是否成功以及RT-PCR擴增反應是否成功的參照；綜合考慮樣品Ct值、陽性對照、陰性對照、空白對照、過程控制病毒以及外加擴增控制RNA的結(jié)果，最終判定結(jié)論，防止了假陽性假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

我國時有諾如病毒食物中毒爆發(fā)事件報道。但目前對諾如病毒污染食品的種類、污染水平、病毒型別的研究尚不全面[10-13]。諾如病毒在實際食品檢測中含量較低，在一些樣品中的回收率極低[14]，由于諾如病毒在食品中不能復制繁殖，所以在體外培養(yǎng)基本不能實現(xiàn)，在食品中更不能復制繁殖、也沒有針對諾如病毒的疫苗。食品中的諾如病毒主要源自糞便、污水污染，病毒濃度均很低。檢測食品中諾如病毒的方法主要是通過遺傳物質(zhì)擴增或抗原識別等方法，其中核酸擴增方法因靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點為多個國際機構(gòu)廣泛使用[15-16]。

本研究顯示，蘭州和沿海城市一樣存在諾如病毒爆發(fā)的潛在風險，因此，要加強對食品安全管理的力度，通過各種媒體渠道廣泛普及食品安全知識，提高民眾預防食源性疾病的安全防控意識。相關(guān)研究單位也應更廣泛的開展數(shù)據(jù)調(diào)研，從而獲得更全面的食源性病毒污染狀況與食品安全調(diào)查資料，為人民群眾的身體健康、生命安全保駕護航?！?/p>