陳秉瑞 范燚 綜述 王連生,2 審校

(1.南京醫(yī)科大學(xué)研究生院，江蘇 南京 210000； 2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京 210029)

1 背景

長期以來，心臟被認(rèn)為是有絲分裂后的器官,心肌細(xì)胞被認(rèn)為不具有分裂或再生能力。近年在斑馬魚和新生小鼠中發(fā)現(xiàn)了心臟再生能力，對于心臟損傷治療的研究來說無疑是突破性的進(jìn)展，對于哺乳動物甚至人類的心臟修復(fù)有著重要的提示意義。新生小鼠的心臟再生有多方面因素參與其中：DNA甲基化、miRNA(小RNA)、關(guān)鍵蛋白、信號通路、蛋白激酶等都在新生小鼠心臟再生中發(fā)揮重要作用?；蛘{(diào)節(jié)機(jī)制中，DNA的甲基化在器官發(fā)育、組織分化和細(xì)胞特化等方面發(fā)揮雙向調(diào)控作用。其中，啟動子區(qū)域的DNA甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制存在密切聯(lián)系[1]。miRNA對基因表達(dá)有著重要的影響，可以協(xié)同作用于重要細(xì)胞通路中的多種成分，影響細(xì)胞表型。多個miRNA簇在小鼠發(fā)育早期表達(dá)，維持組織特異性，參與祖細(xì)胞識別。蛋白激酶誘導(dǎo)蛋白質(zhì)磷酸化，激活多條信號通路和多種生物過程，在生物的生長發(fā)育中有著至關(guān)重要的作用。

2 DNA甲基化參與出生后心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制

出生后1～7 d，在與新生小鼠心血管系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的基因的啟動子中，存在著許多差異性甲基化區(qū)域。這些區(qū)域中的絕大多數(shù)都會在生后第7天出現(xiàn)DNA的甲基化增加[2]。同時，新生小鼠心臟的再生能力在生后第7天出現(xiàn)明顯的下降，這提示，DNA的甲基化很可能抑制了心肌細(xì)胞的再生能力。研究表明，在生后7 d甲基化修飾增加的基因主要參與了心臟的發(fā)育，并且是多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用目標(biāo)。例如，心臟特異性肌增強(qiáng)因子Mef2可以與GATA4和Tbx5協(xié)同作用，促使新生成的纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化[3]。Tead4上調(diào)Hif1α，刺激缺血后的血管發(fā)育和心臟恢復(fù)[4]，這些作用都有助于促進(jìn)心臟再生。生后7 d時，Mef2和Tead4都出現(xiàn)大量的甲基化富集區(qū)，使其轉(zhuǎn)錄受到抑制，表達(dá)減少，心肌細(xì)胞增殖能力隨之下降。

3 miRNA參與新生小鼠心肌細(xì)胞增殖再生

3.1 miRNA 302-267簇抑制Hippo通路

miRNA 302-267簇表達(dá)于胚胎形成早期，參與維持胚胎期心肌細(xì)胞持續(xù)、高水平的增殖活動，最終引起心臟增大，在出生后心臟中不表達(dá)。然而，通過構(gòu)建過表達(dá)的小鼠模型，在出生后心臟中持續(xù)再表達(dá)該簇，該簇可以重新激活心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖再生，延長心肌細(xì)胞去分化狀態(tài)，抑制成熟心肌細(xì)胞表型，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生。此外，Ying等在成年小鼠心肌梗死后通過尾靜脈注射該簇，使其在心臟內(nèi)聚集，觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)了去分化現(xiàn)象，增殖增加，凋亡減少[5]。

Hippo信號通路是經(jīng)典而保守的調(diào)節(jié)器官大小和細(xì)胞增殖的信號通路，其主要成分包括上游哺乳動物不育系20樣激酶(MST)、腫瘤抑制因子(LATS)與下游YAP蛋白等，抑制MST和LATS導(dǎo)致YAP進(jìn)入細(xì)胞核激活基因表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖[6]。miRNA 302-267簇通過部分地作用于Hippo信號通路的多種成分來發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的效應(yīng)。研究表明，miRNA 302-267簇過表達(dá)導(dǎo)致MST1、LATS2的表達(dá)下降；敲除該基因簇則會使前述基因表達(dá)增加，從而增加YAP蛋白的磷酸化，維持YAP蛋白的無活性形式，減少其向胞核的轉(zhuǎn)移。以上證據(jù)說明miRNA 302-267簇通過抑制這些基因來抑制Hippo通路的活性，從而發(fā)揮促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的功能。

3.2 miRNA-204抑制核轉(zhuǎn)錄因子Jarid2

miRNA-204在腫瘤形成、眼的發(fā)育、糖尿病及肺動脈高壓等領(lǐng)域被廣泛研究，而在心臟領(lǐng)域研究甚少。miRNA-204參與調(diào)節(jié)人類心臟祖細(xì)胞的增殖和分化，可能對心肌細(xì)胞增殖再生產(chǎn)生影響。另有研究表明，過表達(dá)miRNA-204可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子Jarid2的表達(dá)，從而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白基因CycD1的表達(dá)，引起新生小鼠心肌細(xì)胞增殖[7]。

4 蛋白質(zhì)的作用

4.1 成纖維細(xì)胞生長因子10調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖

成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)10是成纖維細(xì)胞生長因子家族(FGFs)的成員，通過與成纖細(xì)胞生長因子受體(FGFR)相互作用，參與促進(jìn)損傷修復(fù)、毛發(fā)生長、干細(xì)胞增殖分化、腫瘤及器官發(fā)育等多種生命過程。在小鼠心肌損傷后，持續(xù)過表達(dá)FGFR，可以促進(jìn)新生血管形成，改善損傷區(qū)血液循環(huán)，對心功能產(chǎn)生保護(hù)性作用。此外，F(xiàn)GF10還參與心外膜上皮間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：作用于FGFR2b，促使心外膜上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞，并由此促進(jìn)心臟外基質(zhì)形成，有利于心肌細(xì)胞增殖[8]。新生小鼠心室切除后，心外膜細(xì)胞向損傷區(qū)發(fā)生擴(kuò)展，并對治療性FGF10處理能產(chǎn)生增殖反應(yīng)[9]。但是，雖然FGF10在正常心臟中大量表達(dá)，在未損傷的心臟中過表達(dá)FGF10則不會影響心肌細(xì)胞的數(shù)量。這說明，F(xiàn)GF10能在一定程度上促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖反應(yīng)，但其單獨(dú)作用尚不能啟動心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。

4.2 GATA4上調(diào)FGF16表達(dá)

GATA家族成員屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，包含一個或多個高度保守的鋅指-DNA結(jié)合域，能特異性結(jié)合在含HGATAR的DNA結(jié)構(gòu)域上。脊椎動物包含6種GATA因子，其中GATA4在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用。GATA4參與調(diào)節(jié)多種心臟特異性功能基因，這些基因?qū)π律呐K發(fā)育尤為重要,參與心肌細(xì)胞的分化、遷移、肥大、纖維化和存活等重要的生命過程。近來研究表明特異性敲除心肌細(xì)胞中的GATA4會導(dǎo)致新生心臟損傷后無法啟動心肌再生程序，出現(xiàn)纖維疤痕修復(fù)。在進(jìn)一步的研究中，利用腺相關(guān)病毒AAV9在心臟中過表達(dá)FGF16，可以部分地挽救GATA4敲除引起的表型，證明了GATA4通過直接上調(diào)FGF16表達(dá)發(fā)揮效應(yīng)[10]。這說明GATA4/FGF16軸參與了新生心臟再生的調(diào)節(jié)。此外，F(xiàn)GF2在非心肌細(xì)胞中表達(dá)，能夠促進(jìn)心肌肥大、瘢痕修復(fù)[11]。FGF16可以通過競爭性結(jié)合FGFR1c來抑制FGF2的功能，從而抑制心肌肥厚和纖維化[12-13]，促進(jìn)心肌損傷修復(fù)再生。

4.3 Meis1抑制新生心臟再生

Meis1屬于TALE同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，是胚胎發(fā)育期心臟分化的中心調(diào)節(jié)因子[14]，參與維持心臟的正常發(fā)育，但其在心肌細(xì)胞周期中的作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Meis1會影響細(xì)胞周期活性和生后心肌細(xì)胞的胞核形成，同時又不會增加心肌細(xì)胞凋亡。另一方面，在小鼠中過表達(dá)Meis1不會降低心臟質(zhì)量，但會抑制新生心臟心肌細(xì)胞的再生，同時上調(diào)周期蛋白依賴性激酶抑制因子[15]。這說明Meis1過表達(dá)會阻滯未成熟心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期。雖然目前還不能說明Meis1 激活的具體機(jī)制，但總體來說，Meis1表達(dá)伴隨3種Hox基因上調(diào)，以穩(wěn)定其DNA結(jié)合能力，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。

4.4 松弛素上調(diào)心臟轉(zhuǎn)錄因子并增加細(xì)胞存活

松弛素(RLX)是一種心臟激素，由心肌細(xì)胞產(chǎn)生，能夠與特異性心肌受體結(jié)合，在新生階段的心臟發(fā)育中發(fā)揮促進(jìn)作用。研究表明，RLX應(yīng)用于新生小鼠心臟，可以上調(diào)GATA4、Nkx2-5等心臟轉(zhuǎn)錄因子[16]。這些轉(zhuǎn)錄因子在心臟成熟期間可以誘導(dǎo)心臟特異性的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，并通過發(fā)揮抗凋亡作用增加細(xì)胞存活，從而促進(jìn)心肌再生。但是，RLX對心肌細(xì)胞的作用是雙相的。在小鼠出生后24 h內(nèi)，RLX促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖；24～48 h，RLX會降低心肌細(xì)胞增殖的速率；而在出生48 h后，RLX就無法影響心肌細(xì)胞增殖[17]。

5 利用蛋白激酶治療心臟損傷的嘗試

5.1 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1與ERBB家族的協(xié)同作用

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)及其酪氨酸激酶受體ERBB4、ERBB3和ERBB2在心臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用[18-20]。其中ERBB2主要在胚胎、生后和新生心臟中表達(dá)，并促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖[18]。ERBB2并不與配體結(jié)合，但對其他ERBB受體與配體的結(jié)合具有穩(wěn)定作用，從而增強(qiáng)配體誘導(dǎo)的受體信號。在心肌中，ERBB2主要與ERBB4協(xié)同作用。Ganapathy等[21]在小鼠出生后的一個月內(nèi)，每天給予小鼠皮下注射rNRG1 100 ng/g，發(fā)現(xiàn)NRG1與ERBB2結(jié)合后， 會上調(diào)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和蛋白激酶B，下調(diào)GSK3β，從而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的肥大、去分化和增殖。其中，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶上調(diào)會抑制心肌細(xì)胞去分化，減少肥大反應(yīng)；蛋白激酶B上調(diào)則會增強(qiáng)心肌細(xì)胞去分化，減少肥大反應(yīng)；GSK3β下調(diào)增加β連環(huán)蛋白聚集和RUNX1表達(dá)，促進(jìn)依賴β連環(huán)蛋白的細(xì)胞周期活性。ERBB2對GSK3β的抑制作用可以使心肌細(xì)胞在7 d齡后仍然保持穩(wěn)定的去分化和增殖能力，從而延長出生后心臟再生時間窗。這些都有助于促進(jìn)心臟再生，同時不會引起其他臟器的生長。

5.2 D492上調(diào)自噬促進(jìn)損傷修復(fù)

自噬過程參與細(xì)胞生長、分化和細(xì)胞物質(zhì)的平衡，腺苷酸依賴的蛋白激酶(AMPK)通路和mTOR通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要信號通路。AMPK通路可以通過促進(jìn)UlK1的磷酸化直接調(diào)節(jié)自噬，或者抑制mTOR通路來間接調(diào)控，mTOR通路則通過抑制UlK1負(fù)性調(diào)節(jié)自噬[22-23]。D492是AMPK選擇性激動劑，已被證明可在人類前列腺腫瘤PC3細(xì)胞中引起自噬。Yang等在新生小鼠原代心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)氧糖剝奪和復(fù)氧OGD/R，并用成年小鼠構(gòu)建了心肌缺血再灌注損傷模型[24]。給予心肌細(xì)胞D492處理后，D492顯著地上調(diào)AMPKα磷酸化，下調(diào)p70S6和4EBP1的磷酸化，從而激活A(yù)MPK通路，抑制mTOR通路，引起細(xì)胞自噬，減少OGD/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮了保護(hù)性作用。在成年小鼠的缺血再灌注損傷模型中，D492也通過同樣的途徑，減少心肌細(xì)胞受到的缺血性損傷。

6 結(jié)論與展望

近年來的研究表明，低等脊椎動物和部分新生的哺乳動物的心臟及其他內(nèi)臟損傷后可以完全再生。成人的心肌細(xì)胞可以較低的速率再生，但這種低度的再生并不能修復(fù)心臟的缺血性損傷。心臟在發(fā)育過程中關(guān)閉自身再生的能力，從進(jìn)化的角度而言，其優(yōu)勢尚不為人所知。心臟再生治療已發(fā)展出多種手段，包括細(xì)胞替代療法、內(nèi)源性祖細(xì)胞群激活、心肌細(xì)胞的細(xì)胞周期重啟和細(xì)胞系直接重編程；但是由于成年患者的內(nèi)源性生理限制和翻譯屏障，這些治療方法的效果都不夠理想。目前的研究表明，蛋白激酶能夠增強(qiáng)內(nèi)源性再生能力，促進(jìn)新生和成年小鼠的心臟損傷修復(fù)，向臨床轉(zhuǎn)化的前景尤為可觀，值得繼續(xù)深入地研究。