孟曉智，蘇貴森，卓品利, 2，王 超，張 帥，倪嘉豪，徐年軍, 2 ，李亞鶴, 2

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211； 2. 浙江省海洋生物工程重點實驗室， 寧波 315211)

自2007年以來，中國沿海爆發(fā)了大規(guī)模的滸苔綠潮，且呈現(xiàn)出常態(tài)化、連續(xù)性的爆發(fā)趨勢，這在一定程度上破壞了當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)系統(tǒng)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖、旅游及居民生活等帶來了一定的負面影響[1]。國內(nèi)外學(xué)者從多個方面對滸苔綠潮進行了相關(guān)研究，包括滸苔的生活史、繁殖方式、爆發(fā)源頭及機制、種質(zhì)鑒定及光合生理等[2-6]。普遍認為，滸苔是一種廣溫、廣鹽性海藻，繁殖方式復(fù)雜多樣[7]，具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力[8]。初步認定滸苔綠潮的爆發(fā)機制多為海洋環(huán)境要素(溫度、光照強度、鹽度等)的變化、快速增值能力及海水富營養(yǎng)化等[9]，但已有的研究多限于其最適環(huán)境條件的摸索。

湯文仲等[10]運用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)探討了溫度、光照強度對緣管滸苔(Ulvalinza)光合作用的影響。結(jié)果表明，緣管滸苔的最適溫度為25℃，最適光照強度為72 μmol/m2·s，但海藻間的種間差異也是存在的，相比于緣管滸苔，滸苔對溫度、鹽度變化具有較強的適應(yīng)能力[11-12]。此外，滸苔生長過程中形態(tài)學(xué)變化也受溫度、鹽度的影響[13]，溫度、鹽度的升高抑制了滸苔側(cè)枝的生成，但促進了單個側(cè)枝的生長，且溫度、鹽度具有顯著的交互效應(yīng)[14]。韓紅賓等[15]首次系統(tǒng)地探討了溫度、光照強度分別對滸苔孢子/配子的放散和萌發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滸苔孢子/配子的放散和萌發(fā)具有不同的適宜溫度和光照強度的能力，即滸苔生活史的不同階段對溫度、光照強度的響應(yīng)不同，那么，二者對滸苔幼苗的光合生理有怎樣的復(fù)合效應(yīng)，需進一步研究。另外，在江浙一帶，滸苔基于其較高的營養(yǎng)價值被廣泛食用，如滸苔多糖具有降血脂作用[16]，是一種具有開發(fā)前景的海洋食品。本文以滸苔幼苗(約長8～10 cm)為材料，設(shè)置3個溫度梯度和2個光照強度，研究溫度和光照強度對滸苔幼苗生長、光合生理的復(fù)合效應(yīng)，一方面為研究滸苔綠潮的爆發(fā)提供基礎(chǔ)資料；另一方面也為滸苔的規(guī)模化養(yǎng)殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種滸苔(U.prolifera)由浙江象山旭文海藻開發(fā)有限公司提供，保種在光照培養(yǎng)箱(GXZ，寧波江南儀器廠)中，保種的條件為：溫度15℃；光照強度30～40 μmol/m2·s。培養(yǎng)基采用f/2加富[17]的滅菌人工海水(海水鹽度調(diào)至25°)。

1.2 實驗設(shè)計

實驗設(shè)置3個溫度梯度(20℃、25℃和30℃)和2個光照強度[250 μmol/m2·s(預(yù)實驗測定其光合放氧-光照強度響應(yīng)曲線，顯示該光強接近其飽和光強，標記為高光)、70 μmol/m2·s(預(yù)實驗顯示，該光強在光補償點之上)]。起始鮮重約為0.1 g的滸苔培養(yǎng)在6個不同處理(低溫低光：20℃+70 μmol/m2·s；中溫低光：25℃+70 μmol/m2·s；高溫低光：30℃+70 μmol/m2·s；低溫高光：20℃+250 μmol/m2·s；中溫高光：25℃+250 μmol/m2·s；高溫高光：30℃+250 μmol/m2·s)下，每天測定鮮重，每兩天更換一次培養(yǎng)基(培養(yǎng)基同上)，生長速率穩(wěn)定后進行葉綠素?zé)晒庑?、暗呼吸及光合放氧能力的測定。

1.3 生長速率的測定

在每天的同一時間(約13: 00)進行滸苔鮮重的測定，具體操作如下：用長鑷子將滸苔取出，用吸水紙吸干藻體表面的水分(為減少操作誤差，該工作由同一個人操作)，稱鮮重。相對生長速率(RGR；%/day)=Ln(Wn/Wn-1)/(tn-tn-1)× 100，Wn-1、Wn分別為tn-1、tn時的藻體鮮重。

1.4 葉綠素的提取及測定

取一定重量的藻體放入15 mL離心管中，加入5 mL甲醇，放置于4℃冰箱中，過夜提取后用紫外分光光度計(UV6100A，上海元析儀器有限公司)進行全波段掃描(280～750 nm)。而后根據(jù)公式Chl a=15.65A666-7.34A653計算葉綠素a(Chl a)的含量[18]。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

通過葉綠素調(diào)制熒光儀(water PAM)測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。1)最大(Fv/Fm)及培養(yǎng)光強下的有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)：不同處理的樣品在黑暗條件下處理15 min，在培養(yǎng)光強下(光化光接近培養(yǎng)光強)測定葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線，獲得Fv/Fm及Fv′/Fm′。2)快速光響應(yīng)曲線(P-E curve)的測定：設(shè)置8個光強梯度(114、167、257、379、570、861、1218及1692 μmol/m2·s)，每個光強梯度持續(xù)時間為10 s，飽和脈沖為5000 μmol/m2·s。并根據(jù)rETR=E/(aE2+bE+c)進行曲線擬合，其中，rETR為相對電子傳遞速率，E為光化光強度。根據(jù)擬合參數(shù)計算最大相對電子傳遞速率(rETRmax)、表觀光能利用效率(α)及飽和光強(Ek)，計算公式如下：rETRmax=1/(b+2(a×c)1/2);α=1/c;Ek=rETRmax/α[19]。

1.6 暗呼吸和光合放氧能力的測定

采用液相氧電極(Hansatech，英國)進行暗呼吸和光合放氧能力的測定。取一定鮮重的滸苔(約0.015 g)置于反應(yīng)槽中(含2 mL預(yù)先在培養(yǎng)溫度下充氣的新鮮培養(yǎng)基)，由恒溫水槽控制溫度。黑暗條件下反應(yīng)槽內(nèi)O2濃度的變化速率即為暗呼吸的速率(Rd)，采用LED燈提供外源光強，通過調(diào)控LED燈和反應(yīng)槽的距離獲得各自培養(yǎng)光強下的凈光合放氧速率(Pn)，并計算總光合放氧速率(Pg；Pg=Rd+Pn)及Rd與Pg的比值(Rd/Pg)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖，使用SPSS18.0進行顯著性分析，顯著水平設(shè)置為P< 0.05，顯著性通過在圖中或者表格中標注不同的小寫字母來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下的生長和葉綠素含量

相比于低光處理，高光顯著促進了滸苔的生長，在溫度20℃、25℃及30℃條件下，增幅分別高達70%、120%及130%。溫度從20℃升高至25℃對滸苔生長、葉綠素含量的影響不顯著，但升高至30℃抑制其生長(圖1-A)，提高Chl a的含量，尤其是低光培養(yǎng)時，和20℃相比，Chl a含量的增幅高達100%(圖1-B)。

2.2 不同處理下的光化學(xué)參數(shù)

整體來說，本實驗所選的溫度、光照水平對滸苔最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響不顯著，各個培養(yǎng)條件下的Fv/Fm基本維持在0.7～0.8之間(圖2-A)。同時，不同處理的有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)基本維持在0.51～0.56之間，但在培養(yǎng)溫度為高溫30℃和光照條件為高光時，滸苔的Fv′/Fm′顯著降低，相比于低光處理，降幅約為28%(圖2-B)。

隨著光強的增加，滸苔的相對電子傳遞速率逐漸增加，而后趨于平穩(wěn)(圖3)，其光能利用效率(α)在不同處理間差異不顯著。但高光條件下，低溫(20℃、25℃)培養(yǎng)的滸苔具有較高的最大相對電子速率(rETRmax)，而在30℃時，該值顯著降低。低光條件下，溫度對滸苔的rETRmax、α及飽和光強(Ek)的影響不顯著(表1)。

表1 滸苔在不同處理下的光合作用速率(rETR)與光強關(guān)系的最佳擬合參數(shù)

rETRmax：最大相對電子傳遞速率；α：表觀光能利用效率；Ek：飽和光強(n=3)。不同字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)

圖1 不同處理下滸苔的相對生長速率(A)和葉綠素a(Chl a)的含量(B，n=3)

不同字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)；下同

圖2 不同處理下滸苔的最大(Fv/Fm；A)及有效光化學(xué)效率(Fv′/Fm′；B)

圖3 不同處理下滸苔的相對電子傳遞速率

2.3 不同處理下的暗呼吸和光合放氧能力

相比于低光處理，光照強度的增加提高了滸苔的暗呼吸能力，尤其是在溫度25℃、30℃條件下，增幅分別約為60%和80%。同時，相比于20℃，其暗呼吸速率在25℃、30℃條件下也被顯著提高，尤其是在25℃、高光條件下(圖4-A)。

圖4 不同處理下滸苔的暗呼吸(A)、凈光合放氧速率(B)及呼吸與總光合放氧速率比值(C)

低光條件下，溫度變化對滸苔的凈光合放氧速率影響不顯著，但在高光條件下，該值在25℃時最高，而20℃、30℃均抑制滸苔的光合放氧速率(圖4-B)。通過計算獲得不同培養(yǎng)條件下滸苔暗呼吸和總光合放氧速率的比值，發(fā)現(xiàn)該比值在高光低溫條件下最低，但隨著溫度的增加，光照強度對其影響逐漸降低(圖4-C)。

3 討論

滸苔具有復(fù)雜的繁殖方式和較強的環(huán)境耐受能力，對溫度、鹽度和光照強度等都有廣泛的適應(yīng)性[8]。有研究表明，在營養(yǎng)鹽充足的前提下，適宜的溫度和鹽度是誘導(dǎo)滸苔爆發(fā)的關(guān)鍵因素[20]。光照是海藻光合作用的能量來源，光照強度的大小在一定程度上決定著海藻光合作用的強弱和生長的快慢。有研究表明滸苔(U.prolifera)的最適光照強度為100～120 μmoL/m2·s[8, 21]，緣管滸苔(U.linza)的最適光照強度為72 μmoL/m2·s[10]，但本研究的結(jié)果顯示，在3個溫度條件下，相比于低光70 μmoL/m2·s，高光250 μmoL/m2·s顯著促進了滸苔的生長(圖1-A)。吳洪喜等[8]的研究中采用了連續(xù)光照模式，本研究采用的是光暗比為12:12，從這個角度來說，二者的研究結(jié)果相似，但顯著高于緣管滸苔的最適光照強度(72 μmoL/m2·s)，這一方面體現(xiàn)了種間差異，另一方面可能與培養(yǎng)溫度和鹽度有關(guān)。在緣管滸苔的研究中[10]，溫度、光照強度分別為單因子試驗，且在光照強度單因子試驗中沒有指出培養(yǎng)溫度、鹽度，但其前期的培養(yǎng)溫度為15℃，而本實驗所設(shè)置的3個溫度均高于15℃。劉榆莎等[22]的研究顯示，滸苔生長對光照強度的響應(yīng)受鹽度的調(diào)節(jié)。滸苔的生長具有低輻照適應(yīng)性，高光強促進滸苔孢子的釋放[23]。韓紅賓等[15]的研究也顯示，在60～240 μmoL/m2·s的范圍內(nèi)，孢子/配子的放散與光照強度成正比，并在300 μmoL/m2·s達到最大值，其萌發(fā)的最適光照強度為120 μmoL/m2·s，結(jié)合本研究的結(jié)果，即滸苔幼苗在高光250 μmoL/m2·s條件下的生長速率遠高于低光70 μmoL/m2·s，可以推測生活史不同階段的滸苔藻體對光照強度的要求及適應(yīng)能力不同，這在一定程度上與滸苔綠潮爆發(fā)的區(qū)域性、時間性及連續(xù)性密切相關(guān)。同時，滸苔綠潮爆發(fā)時，生活在綠潮表層的藻體(接受強的光照強度)通過熱耗散或能量的重新分配，以及降低葉綠素含量等避免高光強對光系統(tǒng)的損傷，而生活在綠潮底層的藻體(接受較低的光照強度)則通過增加葉綠素含量及改變Chl a與Chl b的比值來提高光能利用效率[24]，這與本文的結(jié)果一致，即高光條件下滸苔具有較低含量的Chl a(圖1-B)，也在一定程度上顯示出滸苔較強的環(huán)境適應(yīng)能力[8]。

溫度是影響海藻生長的另一重要因素，滸苔綠潮在不同沿海地區(qū)爆發(fā)的時間不同，一般來說，山東青島的滸苔綠潮基本在夏季爆發(fā)，而浙江寧波滸苔在每年的1、2月份大規(guī)模生長，這與當(dāng)?shù)睾Ｓ蚝Ｋ疁囟扔忻芮械年P(guān)系，滸苔綠潮爆發(fā)的最適溫度是20℃～25℃[25]，這與本文的結(jié)果相似，即實驗所設(shè)置的兩個光照強度下，滸苔在20℃、25℃具有較高的生長速率(圖1-A)。湯文仲等[10]的研究顯示，溫度和光照強度對緣管滸苔最大相對電子傳遞速率的影響具有顯著的交互作用，該現(xiàn)象與本研究的結(jié)果相似，即高光、高溫顯著降低了滸苔的Fv′/Fm′(圖3-B)和rETRmax(圖4、表1)，但在低光條件下，溫度的效應(yīng)不顯著，主要是因為高光條件下，光照強度和溫度的升高在一定程度上破壞了滸苔光系統(tǒng)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其失活，進而抑制該條件下滸苔的生長(圖1)。Gao等[14]的研究表明，培養(yǎng)在20℃和25℃環(huán)境中的滸苔具有相似的相對生長速率，這與本研究的結(jié)果相似(圖1-A)，但溫度的變化影響滸苔分枝的數(shù)量及長度，具體表現(xiàn)為溫度從20℃升高到25℃，滸苔分枝的數(shù)量增加，但其長度降低，即溫度變化影響滸苔的形態(tài)，而本實驗是溫度的短期實驗，沒有觀測到不同溫度下滸苔的形態(tài)變化。

整體來說，溫度、光照強度共同影響滸苔的生長，并具有顯著的種間差異，且生活史的不同階段對二者的敏感性不同，但本實驗是室內(nèi)短期實驗，在自然界中溫度、光照強度等環(huán)境因子的變化多樣，它們對滸苔綠潮的爆發(fā)又起到怎樣的作用，還需進一步深入的探討。