成 杰， 武 迪， 錢改改, 鞏東輝,2， 蘇勇寧， 陳 高 ， 季 祥,2

(1. 內(nèi)蒙古科技大學 生命科學與技術(shù)學院， 包頭 014010； 2．內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點實驗室， 包頭 014010； 3. 廈門大學 海洋與地球?qū)W院， 廈門 361000；4. 山東省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)研究中心, 濟南 250000； 5. 內(nèi)蒙古再回首生物工程有限公司， 鄂爾多斯 016100)

能源是推動人類社會發(fā)展的重要基礎，化石能源的使用同時也帶來了環(huán)境污染、溫室效應等嚴重的問題[1-2]。生物燃料(Biofuel)由于環(huán)境友好、可再生性而備受關(guān)注[3-4]。生物柴油作為液體燃料可直接應用于柴油機等常規(guī)設備[5]。能源微藻具有光合效率高、成本低、含油量高、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點[6-9]，被認為是未來生物柴油的主要原料[10-11]。目前微藻生物柴油成本較高[12]，而降低能源微藻成本的關(guān)鍵在于：1)選育獲得高效適合工業(yè)化生產(chǎn)的藻株；2)建立利用低成本規(guī)模微藻培養(yǎng)技術(shù)和設備；3)進一步提高藻細胞內(nèi)的油脂含量。

通過調(diào)控藻細胞油脂代謝途徑來提高藻細胞油脂積累是目前研究的熱點。本研究選取了蘋果酸、檸檬酸兩個中間代謝物，通過調(diào)控與乙酰輔酶A相關(guān)的代謝反應，促使代謝流向油脂合成的方向移動，為進一步揭示油脂代謝中的關(guān)鍵調(diào)控因子，為促進微藻生物能源研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

藻種斜生柵藻(ScenedesmusobliquusXJ002)為內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點實驗室保存。取若干個250 mL錐形瓶，分別向其中加入一定數(shù)量的經(jīng)高壓蒸汽滅菌BG11培養(yǎng)基以及檸檬酸、蘋果酸儲備液，使每個錐形瓶中檸檬酸、蘋果酸的終濃度分別為0.00、0.01、0.05和0.15 g/L，每組重復3次。 然后加入XJ002藻株，搖勻，藻液的最終體積為 150 mL，初始OD680值為0.270，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25℃±1℃，光照強度4800 lx，光暗周期14 h∶10 h，靜置培養(yǎng)，每天定時搖勻3次，并每隔24 h 改變各錐形瓶的位置。

1.2 實驗方法

藻細胞內(nèi)光合色素的提取參照Sartory等[13]方法。藻細胞葉綠素熒光特性通過植物效率分析儀(PEA, Hansatech)測定。測定前，取不同處理組的藻細胞，利用BG11基礎培養(yǎng)基將各個處理組的吸光度OD680調(diào)成同一水平，并置于暗環(huán)境中30 min，在暗環(huán)境中進行測定操作。各熒光參數(shù)的意義見表1。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的各處理組藻液適量，尼羅紅染色測定藻細胞內(nèi)油脂含量(%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝中間物的添加對XJ002藻株生物量的影響

圖1表示在藻細胞一個培養(yǎng)周期(15 d)內(nèi)，檸檬酸與蘋果酸對XJ002藻細胞生物量的影響。由圖1可知，從第2天開始，不同濃度檸檬酸與蘋果酸處理對藻細胞生物量的影響表現(xiàn)出一定的差異。低濃度的檸檬酸與蘋果酸處理對藻細胞生長影響不大，高濃度的檸檬酸與蘋果酸處理，藻細胞的生長狀態(tài)受到明顯的抑制，0.15 g/L 的蘋果酸與檸檬酸處理組的藻細胞生物量比對照組分別降低了23.08%和21.21%(P<0.01)。藻細胞只有在一定的pH值范圍內(nèi)(7.7 ～ 9.4)才可以保持良好的生長狀況，超出這個范圍，藻細胞的各項生理功能會受到影響，導致藻細胞生長緩慢，甚至引起藻細胞的死亡。外源檸檬酸與蘋果酸的加入會降低培養(yǎng)基中的pH值，培養(yǎng)基中過低的pH值對藻細胞的生長代謝、光合作用以及藻細胞對營養(yǎng)鹽的攝取都會產(chǎn)生顯著地影響。

表1 JIP-測定所用的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(O-J-I-P)的參數(shù)

圖1不同濃度代謝中間物處理對XJ002藻細胞生長的影響

Fig 1 Effect of various concentrations of metabolic intermediates
on the biomass ofScenedesmusobliquusXJ002

A:檸檬酸；B：蘋果酸

2.2 代謝中間物的添加對XJ002藻株光合色素的影響

表2表明，不同濃度檸檬酸與蘋果酸處理條件下，XJ002藻株胞內(nèi)的光合色素具有顯著的差異。低濃度的檸檬酸與蘋果酸處理對藻細胞光合色素的積累具有輕微的促進作用，隨著檸檬酸與蘋果酸濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素均出現(xiàn)下降的總體趨勢。與對照組相比，0.15 g/L檸檬酸處理時，葉綠素a與類胡蘿卜素分別下降了45.02% 和 48.92%(P<0.01 )。當0.15 mol/L蘋果酸處理時，葉綠素a與類胡蘿卜素分別下降了40.70%和43.25%(P<0.01 )。與蘋果酸相比，檸檬酸降低的幅度更大。葉綠素a作為捕光色素蛋白復合體的重要組分與光合作用密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，高濃度的檸檬酸與蘋果酸處理會降低藻細胞內(nèi)光合色素含量，導致光合效率的下降，進而抑制藻細胞的生長。

表2 不同濃度檸檬酸與蘋果酸對斜生柵藻胞內(nèi)光合色素含量的影響

2.3 添加外源代謝中間物對XJ002藻株葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.3.1 添加外源代謝中間物對XJ002藻株葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響

由圖2可知，不同濃度中間代謝物處理15 d后各處理組的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線有著顯著的差異。低濃度的檸檬酸與蘋果酸處理下，藻細胞快速葉綠素熒光誘導動力學曲線較為集中，隨著檸檬酸與蘋果酸處理濃度的增加，曲線依次呈現(xiàn)出下降的總體趨勢。低濃度的檸檬酸處理組的曲線與對照組有輕微的差異，而低濃度的蘋果酸處理組的曲線與對照組基本沒有差異，說明藻細胞對檸檬酸的毒性效應更敏感。

圖2 不同濃度代謝中間物處理對XJ002藻細胞葉綠素熒光誘導曲線的影響

A:檸檬酸；B：蘋果酸

2.3.2 代謝中間物的添加對XJ002藻株光合作用光系統(tǒng)II反應中心供體側(cè)的影響

Wk值是衡量藻細胞PSII反應中心供體側(cè)放氧復合體是否受損的唯一指標，Wk值的增加說明PSII反應中心供體側(cè)的放氧復合體受損，進而影響了PSII反應中心供應電子的能力以及向下游傳遞電子的效率。由圖3可知，低濃度的檸檬酸與蘋果酸處理導致藻細胞Wk值出現(xiàn)輕微下降的趨勢，高濃度的檸檬酸與蘋果酸處理引起藻細胞Wk值出現(xiàn)顯著增加，當0.15 g/L檸檬酸與蘋果酸處理藻細胞時，Wk值分別是對照組的1.037 倍和1.021 倍(P<0.05)。結(jié)果表明高濃度的檸檬酸與蘋果酸處理破壞了PSII反應中心供體側(cè)的放氧復合體結(jié)構(gòu)。

圖3 不同濃度代謝中間物處理對XJ002藻株光系統(tǒng)II反應中心供體側(cè)Wk值的影響

2.3.3 代謝中間物的添加對XJ002藻株光合作用光系統(tǒng)II反應中心的影響

1)代謝中間物的添加對光系統(tǒng)II最大光化學效率(Fv/Fm)以及基于吸收光的光性能指數(shù)(PIabs)的影響。PSII反應中心最大光化學效率(Fv/Fm)通常被用于反映PSII光化學效率以及預測植物受脅迫程度。一般而言，F(xiàn)v/Fm值在非脅迫條件下基本保持不變，而且不受物種與環(huán)境的影響。當藻細胞受到外界環(huán)境脅迫時，F(xiàn)v/Fm值會出現(xiàn)顯著變化，因而可以作為細胞受到脅迫的指示器。本研究中，不同濃度有機酸處理下，F(xiàn)v/Fm值基本保持不變；低濃度的有機酸處理對光性能指數(shù)(PIabs)的影響不大，高濃度的有機酸處理導致PIabs呈現(xiàn)出下降的趨勢。由圖4可知，與對照組相比，當0.15 g/L檸檬酸與蘋果酸處理藻細胞時，PIabs值分別降低了16.44% 和0.34%。

2)代謝中間物的添加對XJ002藻株光合作用光系統(tǒng)II反應中心能量分配的影響。ABS/RC是指單位反應中心吸收的光能，DIo/RC是指反應中心用于熱耗散的能量，ETo/RC是指反應中心用于電子傳遞的能量。由圖5可知，外源檸檬酸處理對光系統(tǒng)II(PSII)反應中心能量分配影響不大。隨著檸檬酸處理濃度的增加，ABS/RC基本不變，DIo/RC基本不變，ETo/RC有所降低。當0.15 g/L檸檬酸處理藻細胞時，ETo/RC值比對照組分別降低了4.66% (P<0.01 )。外源蘋果酸處理對光系統(tǒng)II(PSII)反應中心能量分配基本沒有影響。

圖4 不同濃度代謝中間物處理對光系統(tǒng)II最大光化學效率(Fv/Fm)以及基于吸收光的光性能指數(shù)(PIabs)的影響

圖5 不同濃度代謝中間物處理處理對光系統(tǒng)II反應中心能量分配的影響

2.3.4 代謝中間物的添加對XJ002藻株光合作用光系統(tǒng)II反應中心受體側(cè)電子傳遞活性的影響

由圖6-A可知，隨著檸檬酸處理濃度的增加，ETo/ABS與ETo/TRo出現(xiàn)降低的總體趨勢，當0.15 g/L檸檬酸處理藻細胞時，ETo/ABS值與ETo/TRo值比對照組分別降低了8.24%和 8.10%(P<0.01)。由圖6-B可知，外源蘋果酸處理對ETo/ABS值影響不大，隨著蘋果酸處理濃度的增加，ETo/TRo出現(xiàn)降低的總體趨勢，當0.15 g/L檸檬酸處理藻細胞時，ETo/TRo值比對照組分別降低了3.50%。圖6-C可知，Mo隨著檸檬酸處理濃度的增加表現(xiàn)出上升的總體趨勢，各處理組間差異顯著(P<0.01 )。當檸檬酸處理濃度為0.15 g/L時，Mo值是對照組的1.09倍(P<0.01 )；Sm隨著檸檬酸處理濃度的增加表現(xiàn)出上升的總體趨勢，各處理組間差異顯著(P<0.01)。當檸檬酸處理濃度為0.15 g/L時，Sm值是對照組的1.13倍(P<0.01)。當檸檬酸處理濃度為0.15 g/L時，VJ值是對照組的1.05倍(P<0.01)。圖6-D可知，高濃度的蘋果酸處理濃度的增加導致Mo、Sm、VJ值均存在增加的趨勢，各處理組間差異顯著(P<0.01)。當蘋果酸處理濃度為0.15 g/L時，Mo、Sm、VJ值是分別是對照組的1.04、1.13和1.23倍(P<0.01)。

圖6 不同濃度代謝中間物處理對光系統(tǒng)II反應中心受體側(cè)電子傳遞活性的影響

圖7 不同濃度代謝中間物處理對XJ002藻細胞總脂含量的影響

2.4 添加外源代謝中間物對XJ002藻株胞內(nèi)總脂含量的影響

由圖7可知，外源檸檬酸與蘋果酸的添加對XJ002藻細胞總脂含量產(chǎn)生了顯著的影響。隨著檸檬酸、蘋果酸處理濃度的增加，XJ002藻株胞內(nèi)總脂含量(%)會有顯著提高。當檸檬酸與蘋果酸處理濃度為0.15 g/L時，XJ002藻株胞內(nèi)總脂含量是對照組的1.85倍和1.34倍。與蘋果酸相比，檸檬酸的處理效果更佳。

各種脂肪酸從頭合成途徑中，合成的原料是各種代謝過程產(chǎn)生的乙酰輔酶A，通過調(diào)控培養(yǎng)條件，研究細胞內(nèi)碳原子的流向，引導碳代謝流向油脂合成的方向。通過對油脂合成起主要作用的碳代謝途徑分析，本研究選取了蘋果酸、檸檬酸兩個代謝中間物，它們在胞內(nèi)均可通過參與三羧酸循環(huán)調(diào)控乙酰輔酶A的代謝，后者可以用于藻細胞油脂的合成。結(jié)果表明，外源檸檬酸與蘋果酸的添加可以提高XJ002藻細胞總脂含量，外源添加低濃度的檸檬酸與蘋果酸，強化了藻細胞內(nèi)碳代謝途徑，在保證藻細胞生物量基本保持不變的情況下還可以進一步促進藻細胞內(nèi)總脂的含量。除此之外，高濃度的檸檬酸與蘋果酸的添加抑制了藻細胞的光合作用，使得胞內(nèi)更多的碳原子用于中性脂的合成，從而使得總脂的含量有了一定程度的提高。

3 結(jié)論

高濃度檸檬酸與蘋果酸的添加導致XJ002藻細胞生物量、葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量顯著下降。與此同時，破壞了光系統(tǒng)II反應中心供體側(cè)放氧復合體的結(jié)構(gòu)，抑制了反應中心供體側(cè)和受體側(cè)電子傳遞活性，顯著提高了XJ002藻株胞內(nèi)總脂含量，與蘋果酸相比，檸檬酸的添加效果更佳。