新型Streptomyces sp.N2代謝粗提物的抑菌活性及其水果保鮮初探

吳志明，鹿承建，章帥文，祁增興，朱曼寧，李昆太

(江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045)

【研究意義】目前，抗生素濫用導(dǎo)致各種病害產(chǎn)生耐藥或抗藥性，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)和食品的生產(chǎn)安全，甚至威脅人類生命健康[1]。因此，在綠色、安全生態(tài)日趨受全球關(guān)注的時(shí)代，愈發(fā)需要新型高效、廣譜安全和低毒環(huán)保的拮抗微生物來抑制或殺死有害微生物，為農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)療領(lǐng)域的可持續(xù)發(fā)展提供有力保障[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】放線菌是許多胞外酶和抗生素的知名生產(chǎn)者，尤其是鏈霉菌屬[4-5]憑借易分離培養(yǎng)、產(chǎn)多種次級(jí)代謝物等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治、食品防腐和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如：紅霉素[6]，梧寧霉素[7]等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前約有60 %的農(nóng)用抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的[8]。其中，吸水鏈霉菌檸檬色變種(S.hygroscopicusvar.limoneus)產(chǎn)生的井岡霉素(Validamycin A)、可可鏈霉菌阿索變種(S.cacaoivar.asoensis)產(chǎn)生的多氧霉素(Polyoxins)和灰色產(chǎn)色鏈霉菌(S.griseochromogenes)產(chǎn)生的滅瘟素(Blasticidin S)已成功運(yùn)用于農(nóng)作物的真菌病害防治中[9]；據(jù)報(bào)道，納他霉素(Natamycin)是一種廣譜高效、被廣泛應(yīng)用于臨床和食品工業(yè)等領(lǐng)域的二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類真菌抑制劑，是恰塔努加鏈霉菌(Streptomyceschatanoogensis)、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)和褐黃孢鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus)等經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝物[10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究先期以水稻紋枯病菌為靶目標(biāo)，分離篩選到一株產(chǎn)新型抗真菌活性物質(zhì)(1-甲基-3-氧代-6-氮雜二環(huán)[3.1.1]-5(7)-庚烯-2-酮，分子式為C6H7O2N，暫命名為農(nóng)抗N2)的鏈霉菌新種Streptomycessp. N2[11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬通過開展Streptomycessp. N2代謝粗提物拮抗不同植物病原真菌、酵母、G+和G-的活性評(píng)價(jià)和探索新型Streptomycessp. N2代謝粗提物對(duì)離體水果的生防實(shí)效及其保鮮作用，為Streptomycessp. N2未來在農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 鏈霉菌 N2(Streptomycessp.N2)分離自云南省昆明市西山國際森林公園；指示菌(本實(shí)驗(yàn)室保存)：革蘭氏陽性G+：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，克氏庫克菌(MicrococcusKristinae)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；革蘭氏陰性G-：惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)，水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)；真菌：酵母菌(Yeast)，辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici)，葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，西瓜枯萎病菌(Fusarriumoxysporumf.sp.niveum)，意大利青霉(Penicilliumitalicum)，黑曲霉(Aspergillusniger)，棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)，煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)，指狀青霉(Penicilliumdigitatum)，水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)，桔青霉(PenicilliumcitrinumThom)，萵苣菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)，水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：用于細(xì)菌的斜面保存和抑菌活性的檢測(cè)；PDA培養(yǎng)基：用于真菌的斜面保存和抑菌活性的檢測(cè)；鏈霉菌N2發(fā)酵培養(yǎng)液：蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米漿20 g，黃豆餅粉10 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備 JW-3022HR型高速冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 N2粗提物的制備 將培養(yǎng)7 d的鏈霉菌N2孢子刮入30 mL帶玻璃珠的無菌蒸餾水中，震蕩20 min后移取5 mL孢子懸液于裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h即得鏈霉菌N2種子液。種子液按10 %的接種量轉(zhuǎn)接至含500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的2 L三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)96 h即為鏈霉菌N2發(fā)酵液；鏈霉菌N2發(fā)酵液經(jīng)兩倍體積乙醇(純度≥90 %)浸提至少24 h后4000 r·min-1離心棄除菌體，上清液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后于10 000 r·min-1離心保留上清液，最后用0.22 μm濾膜過濾除菌即得無菌粗提物原液。用無菌蒸餾水稀釋無菌粗提物原液制成不同濃度藥液，備用。

1.2.2 N2粗提物抑菌譜的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[12]測(cè)定N2粗提物對(duì)12種待測(cè)植物病原真菌的抑制作用，處理組：200 mLPDA與15 mLN2粗提物原液混勻制成含藥平板(Φ90 mm)，用Φ9mm無菌打孔器制取菌塊置于平板中央，以含等量無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5次，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。

參考文獻(xiàn)[13]測(cè)定N2粗提物對(duì)供試酵母菌、革蘭氏陽性G+和G-菌的抑菌活性，用50 mL無菌水將待測(cè)指示菌制成菌懸液后，移取200 μl均勻涂布于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上，15 min后小心放入無菌牛津杯，加入200 μl不同濃度N2粗提物。以無菌水為CK對(duì)照，各處理重復(fù)3次，24 h后測(cè)量抑菌圈直徑并記錄。

1.2.3 建立N2粗提物對(duì)不同植物病原真菌的毒力回歸方程及其MIC的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[14]測(cè)試植物病原真菌對(duì)N2粗提物的敏感性以及N2粗提物相應(yīng)的最低抑菌濃度MIC：將不同濃度無菌N2粗提物與冷卻至60 ℃的PDA培養(yǎng)基混勻制成系列濃度的含藥平板后，采用1.3.2中的方法接種和培養(yǎng)不同植物病原真菌，每處理3～5次重復(fù)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，采用劑量對(duì)數(shù)-抑菌率機(jī)率值法建立毒力回歸方程，計(jì)算EC50；以72 h后抑制病原菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。

1.2.4 N2粗提物對(duì)離體果實(shí)的生物防效測(cè)定 經(jīng)75 %酒精和1 %次氯酸鈉表面消毒后的健康獼猴桃(隨機(jī)挑選、大小一致)，采用有傷接種的方式將活化后的葡萄座腔菌接種于果實(shí)赤道部位一側(cè), 噴施5 mL不同濃度的N2粗提物，并用濕潤(rùn)的無菌棉花蓋住傷口，以均不噴藥但分別接種病原菌和無菌PDA塊為CK和陰性對(duì)照組。置于(25±2)℃恒溫保濕(相對(duì)濕度75 %)培養(yǎng)箱中7 d。觀察并記錄獼猴桃染病面積，參考公式:相對(duì)防效(%)=(CK處理組感病面積-藥液處理組感病面積)×100 %/CK處理組感病面積。

1.2.5 N2粗提物對(duì)不同水果的保鮮作用 將大小、成熟度一致的廣西金黃圣女果、云南夏黑葡萄和雞蛋芒果用清水洗凈晾干后隨機(jī)分成3組，處理組: 2.31 μg·mL-1N2粗提物，陽性對(duì)照組: 10 μg·mL-1納他霉素，CK：清水對(duì)照。用無菌脫脂棉在待測(cè)水果表面均勻涂抹不同處理液后置于保鮮袋中，(30±2)℃恒溫保濕貯藏10 d，各處理3次重復(fù)，每天稱重并計(jì)算失重率，同時(shí)觀察水果顏色、氣味和硬度等貯藏品質(zhì)的變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010、DPS 7.05、Origin 9.0和Adobe Photoshop CS5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2粗提物對(duì)不同植物病原真菌抑菌率的影響

由表1可見，經(jīng)農(nóng)抗N2粗提物處理后12種植物病原真菌的菌落直徑較CK組均明顯減小，尤以農(nóng)抗N2粗提物對(duì)辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、意大利青霉、煙草黑脛病菌和桔青霉的抑制效果較為顯著，抑菌率分別達(dá)83.58 %、94.55 %、96.24 %、88.96 %和85.49 %；由此進(jìn)一步驗(yàn)證了農(nóng)抗N2粗提物中存在廣譜拮抗植物病原真菌的活性物質(zhì)。

2.2 N2粗提物對(duì)酵母菌、革蘭氏陽性G+ 和G-菌的拮抗作用

通過管碟法測(cè)試結(jié)果可知(圖1)：不同濃度N2粗提物對(duì)酵母菌和多種革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌均有顯著的抑制效果，且隨著濃度的升高抑菌圈直徑越大；其中對(duì)G+抑制效果最佳為枯草芽孢桿菌，對(duì)G-抑制效果最佳為水稻黃單胞菌，當(dāng)處理濃度為2.88 μg·mL-1時(shí)抑菌圈大小分別為：(24.82±2.61)和(25.57±1.43)mm；結(jié)合2.1.1結(jié)果可知鏈霉菌N2擁有廣譜拮抗的特性，可能存在多種抗菌活性物質(zhì)。

表1 N2粗提物對(duì)不同植物病原真菌抑菌率的影響

注：a中±SD(standard deviation)表示處理間重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:aThe results were means±SD (standard deviation) of triplicate determinations.

圖1 N2粗提物對(duì)酵母菌、G+ 和G-菌的抑菌圈直徑Fig.1 Inhibition zone diameters of S. cerevisiae, G+ and G- by N2 crude extract

2.3 8種植物病原真菌對(duì)N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌濃度

EC50是有效反映生防菌拮抗病原菌作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，由表2可知，N2粗提物能有效抑制8種供試菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)中N2粗提物對(duì)8種供試菌的EC50值由小到大依次為：辣椒疫病菌、稻瘟病菌、葡萄座腔菌、萵苣菌核病菌、紋枯病菌、煙草黑脛病菌、棉花枯萎病菌和西瓜枯萎病菌，N2對(duì)以上供試菌的MIC值分別為：2.88、2.88、5.77、5.77、5.77、11.53、11.53和13.45 μg·mL-1，與EC50值相符，逐漸變大。

2.4 N2粗提物對(duì)離體獼猴桃的生物防效

經(jīng)離體果實(shí)生防試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：如圖2所示，不同濃度N2粗提物處理后彌猴桃果實(shí)感病面積顯著小于CK組，相比CK組被葡萄座腔菌侵染了(5.05±0.28)cm2的感病面積，經(jīng)23.06、115.30 μg·mL-1藥液處理后相對(duì)防效分別達(dá)7.53 %和46.64 %，差異顯著；230. 60 μg·mL-1能完全抑制葡萄座腔菌在獼猴桃果實(shí)上的感染，同時(shí)陰性對(duì)照組的離體果實(shí)未見感病面積，表明培養(yǎng)環(huán)境良好，排除了其他病原菌對(duì)本試驗(yàn)的干擾；因此可見，N2粗提物具有顯著的生物防效作用。

圖中無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters above the columns represent statistically significant (P<0.05) differences among treatments圖2 N2粗提物對(duì)離體獼猴桃的生物防效Fig.2 The in vitro biocontrol efficacy of N2 crude extract in Actinidia chinensis Planch

2.5 N2粗提物對(duì)3種水果失重率的影響

由圖3可知，貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各處理的水果失重率均呈上升趨勢(shì)，貯藏10 d后圣女果CK失重率為12.62 %，納他霉素和N2處理組分別為10.04 %和7.34 %，均明顯低于CK，與CK差異極顯著(P<0.01)；葡萄CK、陽性對(duì)照和N2處理組失重率分別為15.89 %、13.68 %和11.62 %，且納他霉素和N2處理組相比CK差異顯著(P<0.05)；而芒果各處理間失重率無顯著差異。由此可見，N2粗提物和納他霉素能有效抑制圣女果和葡萄水分的散失，且2.31 μg·mL-1N2粗提物效果較10 μg·mL-1納他霉素更佳。

2.6 N2粗提物對(duì)3種水果貯藏品質(zhì)的影響

由圖4可見，圣女果和葡萄經(jīng)N2粗提物和納他霉素處理10 d后，在貯藏前后相比CK組的果實(shí)顏色及其硬度均無顯著變化，尤以N2粗提物處理組效果最為明顯，且在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組中圣女果果蒂脫落、腐爛并伴有惡心臭味，葡萄表面開裂且出現(xiàn)腐斑。芒果經(jīng)N2粗提物和納他霉素處理5 d后，相比CK組雖失重率無顯著差異，但其貯藏品質(zhì)明顯下降，并隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)芒果表面出現(xiàn)嚴(yán)重腐爛黑斑，散發(fā)腐爛味。因此可以推斷，N2粗提物中的抑菌活性物質(zhì)能有效水果樣品表面有害菌的生長(zhǎng)，提高水果貯藏品質(zhì)。

表2 8種植物病原真菌對(duì)N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌濃度

圖3 N2粗提物對(duì)離體水果失重率的影響Fig.3 Effect of N2 crude extract on isolated fruit weight loss rate

圖4 N2粗提物對(duì)離體水果貯藏品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of N2 crude extract on isolated fruit storage quality

3 討 論

植物病害是影響作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和果蔬采后貯藏最重要的制約因素之一，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，每年因植物病害造成的減產(chǎn)損失高達(dá)總產(chǎn)量的10 %～15 %[15]。其中，70 %～80 %的植物病害是病原真菌侵染所致[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌N2粗提物對(duì)辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉、黑曲霉、棉花枯萎病菌、煙草黑脛病菌、指狀青霉、水稻紋枯病菌、桔青霉、萵苣菌核病菌、棉花黃萎病菌、水稻稻瘟病菌等多種植物病原真菌均具有較強(qiáng)抑菌活性。此外，鏈霉菌次級(jí)代謝系統(tǒng)復(fù)雜，能產(chǎn)生諸多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級(jí)代謝物是鏈霉菌具備高效、廣譜拮抗性的重要原因之一。由研究結(jié)果可推測(cè)：鏈霉菌N2代謝粗提物中存在能有效抑制腐敗酵母、常見的食品腐敗細(xì)菌(枯草芽孢桿菌G+、惡臭假單胞桿菌G-)、植物細(xì)菌性病害(水稻黃單胞菌G-)和動(dòng)物致病菌(大腸埃希氏菌G-和克氏庫克菌G+)的活性物質(zhì)。涂國全[17-18]等在以棉花枯萎病為靶標(biāo)的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選中，從棉花地土壤中分離篩選到一株能抑制酵母、G+、G-和霉菌，產(chǎn)多種抗菌物質(zhì)的鏈霉菌702。與本研究相似，因此推測(cè)Streptomycessp.N2也是一種能分泌多種生物活性物質(zhì)的生防菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物有待進(jìn)一步開發(fā)。

獼猴桃果實(shí)腐爛病主要是由葡萄座腔菌、鏈格孢菌Alternariaalternata、擬莖點(diǎn)霉菌Phomopsismacrospore、富氏葡萄孢盤菌Botryotiniafuckeliana、和層出鐮刀菌Fusariumproliferatum引起的真菌性病害，其中B.dothidea不僅能從獼猴桃果實(shí)傷口侵入引發(fā)病害，更具有從果實(shí)表面直接侵入造成腐爛發(fā)病的能力[19]。本研究通過離體獼猴桃果實(shí)的生物防效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N2粗提物能顯著抑制B.dothidea經(jīng)傷口侵染獼猴桃果實(shí)，防止果實(shí)發(fā)病。果蔬中的水分是維持生命活動(dòng)和保持新鮮品質(zhì)的重要條件，采后貯藏過程中水分的散失是造成果實(shí)外觀色澤、質(zhì)地和風(fēng)味變化的主要原因[20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，N2粗提物能涂抹處理后能有效降低水果的失重率，保持果實(shí)的風(fēng)味和色澤等貯藏品質(zhì)，且其效果較納他霉素更佳。推測(cè)可能是N2粗提物在水果表面形成一個(gè)半透性薄膜，減緩水果的蒸騰和呼吸作用，抑制有害微生物的入侵和滋生，從而延緩水果保質(zhì)期。

4 結(jié) 論

由此可見，Streptomycessp.N2能有效抑制不同病原菌的生長(zhǎng)，其擁有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。但目前針對(duì)除農(nóng)抗N2外的其他Streptomycessp.N2所產(chǎn)活性物質(zhì)的種類結(jié)構(gòu)、特性及其抑菌機(jī)理研究還不清楚，是否本研究中的抑菌和保鮮作用均由農(nóng)抗N2發(fā)揮抑菌作用也有待進(jìn)一步探索。