李曉林，吳陽(yáng)升，林嘉鵬，汪立芹，黃俊成*，賈 斌

【研究意義】經(jīng)卵泡刺激素(FSH)處理一月齡羔羊后，可導(dǎo)致比成年羊多10倍以上的卵泡發(fā)育[1]。故以羔羊?yàn)楣w可以為胚胎體外生產(chǎn)提供大量的卵母細(xì)胞資源，從而縮短世代間隔。對(duì)卵泡發(fā)育相關(guān)基因的篩選與功能研究對(duì)于綿羊的育種具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用前景。我們?cè)诒容^激素誘導(dǎo)羔羊和成年羊激素誘導(dǎo)后發(fā)育卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組差異時(shí)，鑒定到超過(guò)300個(gè)基因的在轉(zhuǎn)錄水平有顯著差異。其中FSH誘導(dǎo)后羔羊血小板糖蛋白4基因(Cluster of differentiation 36 ，CD36)的表達(dá)顯著下調(diào)，而成年羊在激素誘導(dǎo)前后則無(wú)顯著變化[2]。故推測(cè)羔羊卵泡顆粒細(xì)胞中存在與成年羊不同的TSP-1信號(hào)通路，該通路可能與羔羊卵泡的超數(shù)發(fā)育數(shù)量有關(guān)，即與卵泡的募集有關(guān)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】卵泡的發(fā)育和排卵需要大量旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌因子的協(xié)同作用，該過(guò)程中涉及到很多重要的生理過(guò)程，如血管生成[3]。卵巢血管生成的重要調(diào)節(jié)因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，研究表明CD36是影響小鼠血管和卵泡生成的重要因子[4]。CD36是一種跨膜糖蛋白受體，又被稱為脂肪酶轉(zhuǎn)位酶(Fatty acid translocase ，F(xiàn)AT)，B族清道夫受體3(Scavenger receptor class B member 3，SCARB3)等[5]。CD36由CD36基因編碼，位于人的7號(hào)染色體上，有15個(gè)外顯子[6]。CD36蛋白由1個(gè)包含472個(gè)氨基酸的單肽鏈組成。組織成2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域：2 個(gè)非常短的細(xì)胞質(zhì)域和1個(gè)大的糖基化的胞外結(jié)構(gòu)域[7]。研究表明，CD36在人類(lèi)的心臟和腎臟的肌細(xì)胞有大量表達(dá)[8]，比較明確的作用有影響人血管發(fā)生[9]，動(dòng)脈粥樣硬化[10]，炎癥和脂類(lèi)代謝等[11]。目前該基因在綿羊各個(gè)組織中的表達(dá)和對(duì)綿羊卵泡發(fā)育是否有影響還未見(jiàn)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文以新疆阿勒泰羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用PCR擴(kuò)增CD36 CDS區(qū)全長(zhǎng)，對(duì)克隆的CD36的理化性質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，功能域等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。在mRNA水平上分析CD36在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期卵泡中表達(dá)差異，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期為后續(xù)深入研究CD36基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

阿勒泰羊選自新疆畜牧科學(xué)院綿羊繁育基地，在1周歲時(shí)選取5頭健康綿羊進(jìn)行屠宰，取卵巢和其他其他7個(gè)組織(心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢)，放于RNA保護(hù)劑中，4 ℃保存1夜后提取RNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中綿羊CD36基因預(yù)測(cè)序列(XM_012176586.2)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)引物(1對(duì)引物用于擴(kuò)增CD36基因的CDS序列，1對(duì)為實(shí)時(shí)熒光定量引物)。以GAPDH基因作為內(nèi)參基因(登錄號(hào)：AF017079.1)，序列見(jiàn)表1。所有引物自行設(shè)計(jì)后由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

利用Trizol酚-氯仿法抽提綿羊不同組織和不同直徑(< 3 mm，小卵泡；3～5 mm，中卵泡；>5 mm，大卵泡)卵泡總RNA。2 %凝膠電泳后于凝膠自動(dòng)成像儀(Gene)中成像。利用核酸測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的純度和濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以各個(gè)組織和不同直徑卵泡RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行cDNA合成。反應(yīng)體系20 μl：5×TransScriptAll-in-One SuperMix for qPCR 4 μl，gDNA Remover 1 μl，總RNA 1 ng，加ddH2O至20 μl。

1.4 克隆測(cè)序

以綿羊第1條cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為25 μl：cDNA 2 μl，2× Master SupermixTaq酶(北京全式金有限公司)12.5 μl，上下游引物各1μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，10 ℃ 保存。PCR 產(chǎn)物采用DNA柱式膠回收試劑盒(北京全式金)純化后與pMD19-T載體連接。挑取單克隆菌落，接種于含AMP的0.5 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min振蕩3～4 h。根據(jù)菌液PCR結(jié)果，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序(上海生工)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以2 μl不同組織cDNA為模板，25 μl體系另外包括：Green qPCR SuperMix 12.5Ul，上下游引物各1 μl，RNase-free H2O 9 μl。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃ 5 s，引物特異Tm15 min，55 ℃ 3 min，循環(huán)40次。熔解曲線分析: 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，然后以0.5 ℃/10 s的速率從55 ℃緩慢遞增到95 ℃。反應(yīng)在Rochol Light Cycler 480 II熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每次每一板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品、未知樣品(各重復(fù)3次)和1個(gè)陰性對(duì)照。

表1 TSP-1基因的PCR擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

表2 不同物種CD36 基因GenBank登錄號(hào)

表3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)(軟件或網(wǎng)址)

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

基因的mRNA表達(dá)定量采用相對(duì)Ct(ΔCt)法：目標(biāo)基因Ct-GAPDHCt. ΔCt值在進(jìn)行樣品間比較(ΔΔCt)：樣品2ΔCt-樣品1ΔCt。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最終結(jié)果計(jì)算公式為2-ΔΔCt。

1.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

根據(jù)克隆得到的CD36基因序列和從GenBank下載的基因序列核苷酸序列，使用Mega6.0中的鄰接法(NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。不同物種GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表2。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件將CD36的核苷酸序列翻譯成氨基酸，通過(guò)DNAStar等生物信息學(xué)分析軟件和在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、親/疏水性和信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)等，預(yù)測(cè)所要使用的方法見(jiàn)表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD36基因PCR擴(kuò)增及序列分析

由圖1顯示，將阿勒泰羊耳組織CD36基因CDS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到片段長(zhǎng)度為1614 bp，條帶單一，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小相符。

2.2 CD36基因CDS區(qū)序列及蛋白功能位點(diǎn)分析

由圖2表示，經(jīng)測(cè)序和拼接后，得到1419 bp的CDS區(qū)全長(zhǎng)，共編碼472個(gè)氨基酸。與預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_012176583.2)相比，CD36的編碼區(qū)序列完全一致，不存在變異位點(diǎn)。

M：BM2000 DNA marker；1：CD36 PCR擴(kuò)增結(jié)果；2：陰性對(duì)照?qǐng)D1 CD36基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification product of CD36 gene

圖2 綿羊CD36基因核苷酸序列及翻譯氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and translated amino acid sequence of CD36 gene in sheep

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析

利用在線軟件分析，CD36蛋白分子式為C2411H3769N615O680S18，原子總量為7491，分子量約為52.8 ku, 帶正電荷和負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為45和50個(gè)，其理論等電點(diǎn)pI為8.50；經(jīng)計(jì)算CD36蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為32.61(<40)，脂肪指數(shù)為97.01,最大疏水性位于第9位氨基酸(Score: 2.433)，最大親水性位于457位氨基酸(Score: 3.178)；整體來(lái)看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，總平均親水性為0.021(>0)(圖3)；信號(hào)肽分析結(jié)果顯示CD36蛋白原裂解位點(diǎn)(C值)在和聯(lián)合裂解位點(diǎn)(Y值)在氨基酸21位評(píng)分最高(0.186和0.224)，信號(hào)肽存在于氨基酸的1～20位(圖4)；跨膜區(qū)分析CD36蛋白存在兩個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于氨基酸的7～29位和441～463位(圖5)；二級(jí)結(jié)構(gòu)分析TSP-1蛋白含22個(gè)a螺旋(alpha helix) ，31個(gè)β折疊延伸鏈(extended strand)， 24個(gè)轉(zhuǎn)角(turn)和15個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)(圖6)。

圖3 綿羊CD36蛋白的親/疏水性分析Fig.3 Hydrophilic/hydrophobic analysis of CD36 protein in sheep

圖4 綿羊CD36蛋白信號(hào)肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of CD36 protein in sheep

圖5 綿羊CD36蛋白跨膜區(qū)域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of CD36 protein in sheep

利用在線軟件分析CD36蛋白的功能位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，可能存在8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于氨基酸的79，102，172，205，233，247，321，417位；該蛋白還存在41個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括19個(gè)Ser，15個(gè)Thr和7個(gè)Tyr(圖7)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

利用 Mega 6.0軟件構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中，人與獼猴聚為一類(lèi)，灰雁、山羊和原雞聚為一類(lèi)，不同種屬鼠聚為一類(lèi)，鯉魚(yú)、斑馬魚(yú)與其他物種的遺傳距離較遠(yuǎn)，綿羊與牛，水牛的遺傳距離較近(圖8)。

2.5 CD36基因在綿羊在7個(gè)組織及不同直徑卵泡中的表達(dá)譜檢測(cè)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了CD36基因在5頭阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢以及不同直徑卵泡中表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD36基因在7個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在心臟、卵巢等中高表達(dá)，在脾臟、肝臟和脾臟中等表達(dá)，在肌肉中低表達(dá)。其中心與肺中CD36表達(dá)量差異顯著(P<0.05)。在不同直徑卵泡中CD36總體表達(dá)量較低，其中中卵泡中CD36表達(dá)量最高，大卵泡次之，小卵泡中表達(dá)量最低，其中小卵泡與心表達(dá)量差異顯著(P<0.05，圖9)。

圖6 綿羊CD36蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Secondary structure analysis of CD36 protein in sheep

圖7 CD36蛋白存在的N-糖基化和磷酸化位點(diǎn)Fig.7 N-glycosylation and phosphorylation sites in CD36 protein

圖8 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree constructed by NJ method

圖9 CD36基因在綿羊組織中表達(dá)情況Fig.9 Tissues expression profile of CD36 gene in sheep

3 討 論

卵母細(xì)胞的成熟離不開(kāi)卵泡液和顆粒細(xì)胞，卵泡液是前者發(fā)育成熟的重要場(chǎng)所，而顆粒細(xì)胞分泌的蛋白和激素則調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育[12]。CD36又稱脂肪酸移位蛋白，是一種糖基化蛋白，可以結(jié)合多個(gè)配體，介導(dǎo)不同的生物學(xué)過(guò)程。 如CD36結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白1(TSP-1)通過(guò)抑制NO/cGMP信號(hào)途徑抑制血管生成[13]；CD36能在低密度蛋白(LDL)氧化過(guò)程中通過(guò)識(shí)別氧化磷脂(oxPLs)調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)[14]；在作為脂肪酸移位酶時(shí)，CD36同長(zhǎng)鏈自由脂肪酸結(jié)合且有助于后者轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[15]。

研究表明，CD36在多種動(dòng)物卵巢組織中表達(dá)且對(duì)卵泡發(fā)育有一定作用，如敲除CD36基因的小鼠，卵巢上表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和其受體VEGFR-2表達(dá)均上調(diào)，同時(shí)排卵前卵泡數(shù)量顯著增加，黃體數(shù)量卻顯著降低[16]。CD36在大鼠竇狀卵泡早期和黃體期的顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)[17]。隨著牛卵泡直徑的的增大，卵泡液中的CD36蛋白含量逐漸降低，同時(shí)在卵巢黃體形成過(guò)程中，CD36的下調(diào)有助于黃體上血管爆發(fā)式生長(zhǎng)[18]。作為一種存在于多種細(xì)胞中的跨膜蛋白，近年來(lái)CD36在腫瘤中的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系研究中較多，已經(jīng)明確的是CD36調(diào)節(jié)多種功能：參與血管生成，動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥和脂質(zhì)代謝[19-21]。在FSH超排處理羔羊和成年羊后，比較分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)推測(cè)，CD36可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有調(diào)控作用。

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得CD36 基因CDS區(qū)序列。與NCBI上的預(yù)測(cè)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明綿羊與牛，水牛的遺傳距離較近。將克隆到的核苷酸序列及翻譯成的氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CD36蛋白分子量約為52.8 ku，整體來(lái)看親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域。對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CD36蛋白存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，在氨基酸的1～20位有一個(gè)信號(hào)肽。若蛋白質(zhì)序列含有跨膜區(qū)表明其可能是以膜受體的形式發(fā)揮作用，也可能是定位于膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白，信號(hào)肽則是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分 泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈。故本研究的結(jié)果表明，CD36蛋白蛋白可能是以膜蛋白的形式發(fā)揮其生物學(xué)作用。糖基化和磷酸化都是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾方式，通過(guò)在線軟件分析后發(fā)現(xiàn)，CD36蛋白可能存在8個(gè)N-糖基化和41個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果表明CD36蛋白在翻譯后中有豐富的修飾。

研究CD36基因在綿羊各個(gè)組織中的表達(dá)和分布，對(duì)進(jìn)一步了解該基因的蛋白表達(dá)定位、作用的靶組織、及可能作用的功能部位均有重要意義。研究表明，CD36在小鼠，大鼠，牛等動(dòng)物的各個(gè)組織中均有表達(dá)[22-24]。但在綿羊各個(gè)組織中的表達(dá)和分布報(bào)道較少；CD36基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢這7個(gè)組織中都有表達(dá)，在心臟、卵巢等中高表達(dá)，在脾臟、肝臟和脾臟中等表達(dá)，在肌肉中低表達(dá)。表明CD36 基因具有廣泛的組織表達(dá)特征，在綿羊生長(zhǎng)過(guò)程中可能存在廣泛的生物學(xué)作用。不同卵泡直徑卵泡中CD36表達(dá)量存在差異，其中CD36 在直徑為3～5 mm卵泡中表達(dá)量最高，在直徑< 3 mm卵泡中表達(dá)量最低。這在一定程度上反映了CD36 基因可能在綿羊卵泡發(fā)育中具有重要作用。本研究初步探討了CD36 基因的結(jié)構(gòu)和功能，但該基因在卵泡發(fā)育過(guò)程中的作用和機(jī)制需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

本研究利用PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序獲得了CD36基因CDS全長(zhǎng)為1419 bp，共編碼472個(gè)氨基酸。CD36蛋白為脂溶性親水蛋白，具有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，在氨基酸1～20位存在信號(hào)肽，存在8個(gè)N-糖基化和41個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括19個(gè)Ser，15個(gè)Thr和7個(gè)Tyr。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，綿羊與牛的親緣關(guān)系較近，與人、小鼠和雞等禽內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。檢測(cè)不同組織和不同直徑卵泡中CD36 基因發(fā)現(xiàn)：心與肺和小卵泡中CD36 表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，在不同直徑卵泡中總體表達(dá)量較低。