發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肌肉氨基酸，IGF-I基因相對(duì)表達(dá)量及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

胡沈玉，王立改，樓 寶，曾文繁，譚 朋，詹 煒，陳睿毅，劉 峰，謝慶平，徐冬冬

（浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021）

黃姑魚Nibea albiflora屬鱸形目石首魚科黃姑魚屬，俗稱黃婆雞、黃姑子、銅鑼魚等，其生長快，抗病力強(qiáng)，營養(yǎng)豐富，是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類。由于環(huán)境遭到破壞和過度捕撈，黃姑魚的自然資源不斷減少[1-2]。前人相繼在黃姑魚的早期生活史[3]、黃姑魚胚胎及仔稚魚形態(tài)特征[4]、人工育苗養(yǎng)殖[5-6]等方面進(jìn)行了研究。而在黃姑魚飼料營養(yǎng)方面，一些學(xué)者對(duì)黃姑魚飼料中維生素[7]、脂肪[8-9]、蛋白質(zhì)水平[10-11]需求等方面進(jìn)行了研究，目前，發(fā)酵豆粕替代魚粉的研究尚未見報(bào)道。魚粉是黃姑魚飼料中的重要組成成分，近年來魚粉供應(yīng)不足導(dǎo)致其價(jià)格不斷上漲，提高了黃姑魚養(yǎng)殖成本。因此尋找質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的蛋白源成為當(dāng)務(wù)之急。發(fā)酵豆粕是利用有益微生物發(fā)酵豆粕后獲得，有效消除了抗?fàn)I養(yǎng)因子，降低了大、中分子蛋白水平，提高了小分子蛋白含量及氨基酸總量，大大改善了豆粕的營養(yǎng)價(jià)值[12]。本試驗(yàn)以黃姑魚為研究對(duì)象，在黃姑魚配合飼料中以不同比例的發(fā)酵豆粕替代魚粉，研究其對(duì)黃姑魚幼魚肝臟和肌肉中IGF-I基因表達(dá)量及肌肉中氨基酸含量的影響，為黃姑魚飼料中用發(fā)酵豆粕替代魚粉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

試驗(yàn)以發(fā)酵豆粕、豆粕、魚粉和小麥蛋白粉為蛋白質(zhì)源，魚油、豆油和大豆卵磷脂為主要脂肪源，配制含45%魚粉的基礎(chǔ)飼料。以發(fā)酵豆粕替代基礎(chǔ)飼料中0%（FSM0組）、10%（FSM10組）、20%（FSM20組）、30%（FSM30組）、40%（FSM40組）、50%（FSM50組）的魚粉，共配制6組飼料。試驗(yàn)飼料配方見表1，飼料氨基酸成分見表2。原料經(jīng)粉碎后過60目篩，按配方稱重，采用逐級(jí)擴(kuò)大法使之混合均勻，放于攪拌機(jī)中，攪拌的同時(shí)加入適量水分，原料攪拌均勻后放入F-26型雙螺桿擠條機(jī)制成粒徑為2 mm和4 mm的配合飼料，自然風(fēng)干到水分含量大約為10%，分裝后存于-20℃冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)用的黃姑魚取自西軒漁業(yè)科技島試驗(yàn)場(chǎng)人工培育苗種。初步選擇600余尾同齡黃姑魚幼魚暫養(yǎng)于室內(nèi)50 m3水泥池內(nèi)，暫養(yǎng)2周后，選取健康活躍、大小均勻、平均體重為（31.24±0.02）g的360尾魚隨機(jī)分成6組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，飼養(yǎng)在500L水桶中。將6種飼料和18桶魚隨機(jī)分配，每天07：00和16：00各投喂1次。喂食量為魚體重的3%～5%，并每過2周稱重1次以調(diào)整喂食量，飼養(yǎng)8周。飼養(yǎng)期間，水溫（27±2）℃，鹽度28～29。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每桶隨機(jī)選取3尾魚，取肌肉、肝共2種組織樣品置于RNA保存液中，用于IGF-I基因表達(dá)量的測(cè)定；取足夠量的肌肉用于氨基酸組成的分析，于-80℃保存?zhèn)溆?；并取FSM0，F(xiàn)SM20和FSM50組的肝臟固定于波恩氏液中，用于肝臟組織學(xué)觀察。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Tab.1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis)

表2 飼料的氨基酸含量分析（飼料干物質(zhì)%）Tab.2 The amino acid contents in the diets(Dry matter%)

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取組織樣品50 mg于液氮中研磨，加入1 mL裂解液，按（Solarbio）總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定其純度和濃度，OD260/280的值在1.8～2.0之間，說明提取的總RNA質(zhì)量較好。對(duì)提取總RNA做瓊脂糖凝膠電泳，1%的膠濃度，110 V，15 min，以此來檢查總RNA完整性。使用全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

以大黃魚的β-actin基因?yàn)槌旨一?，根?jù)前期克隆得到黃姑魚IGF-I全長基因序列（MG004542）設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表3。

圖1 RNA電泳圖Fig.1 RNA electrophoresis

表3 熒光定量PCR引物Tab.3 Real-time PCR primers

1.4 qRT-PCR反應(yīng)的條件

qRT-PCR選用SYBR Green染色法，采用TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒在ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)下進(jìn)行，采用三步法以20 uL體系進(jìn)行qRT-PCR，在94℃下預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)為40。反應(yīng)結(jié)束后在60～95℃插入溶解曲線。

1.5 肌肉氨基酸含量測(cè)定

用HP1100高效液相色譜法（HPLC 1100，CA，美國）測(cè)定氨基酸含量。

1.6 肝臟組織形態(tài)學(xué)測(cè)定

取用70%乙醇保存的肝臟，在酒精中梯度脫水后用石蠟包埋，切片后用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，后用顯微鏡觀察肝臟組織切片的結(jié)構(gòu)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過2-ΔΔCt法計(jì)算黃姑魚IGF-I表達(dá)量，并使用SPSS19.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析（one-way ANOVA）。同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，以分析不同發(fā)酵豆粕配比下IGF-I表達(dá)量和氨基酸水平差異性當(dāng)P<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式來表示。

2 結(jié)果

2.1 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肌肉氨基酸組成的影響

各組肌肉中的氨基酸組成中（表4），纈氨酸和蛋氨酸均無顯著性差異，其余氨基酸均隨著發(fā)酵豆粕替代水平的提高而呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)。其中FSM30、FSM40和FSM50這3組的肌肉氨基酸組成顯著高于FSM0組(P<0.05)。

2.2 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉下黃姑魚幼魚肝臟IGF-I基因的相對(duì)表達(dá)量

肝臟中IGF-I的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，F(xiàn)SM0組的表達(dá)量設(shè)定為1，如圖2。從圖2可以看出，F(xiàn)SM0組IGF-I基因表達(dá)量最高，F(xiàn)SM50組IGF-I基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。

圖2 發(fā)酵豆粕替代不同比例魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肝臟中IGF-I基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 The effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on liver IGF-I expression of juvenile N.albiflora

表4 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肌肉氨基酸組成的影響（%）（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.4 The effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on amino acids in muscle(Mean±SD)

2.3 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉下黃姑魚幼魚肌肉IGF-I基因的相對(duì)表達(dá)量

肌肉中IGF-I的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，F(xiàn)SM0組的表達(dá)量設(shè)定為1，如圖3。肌肉中IGF-I基因的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中FSM30表達(dá)量顯著高于其它各組。

2.4 不同水平發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肝臟組織形態(tài)的影響

肝臟組織觀察，如圖4所示，隨著發(fā)酵豆粕替代水平的增加，肝細(xì)胞空泡化加劇，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪增多。FSM0組細(xì)胞排列規(guī)則整齊，細(xì)胞核正常；FSM20組的肝細(xì)胞出現(xiàn)少量空泡化；而FSM50組肝臟細(xì)胞空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞輪廓模糊，部分肝細(xì)胞核已經(jīng)消失不見。

圖3 發(fā)酵豆粕替代不同比例魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肌肉中IGF-I基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 The effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on muscle IGF-I expression of juvenile N.albiflora

3 討論

3.1 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肌肉氨基酸組成的影響

豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵可有效降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，將大分子蛋白質(zhì)降解為小肽和游離氨基酸，鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子活性，提高飼料轉(zhuǎn)化效率[13-15]。崔燕燕等[16]表明中華絨螯蟹Eriocheir sinensis飼料在發(fā)酵豆粕替代50%的魚粉后，發(fā)酵豆粕組總必需氨基酸的沉積率比魚粉組高。許文婕等[17]發(fā)現(xiàn)異育銀鯽Carassius auratus gibelio對(duì)發(fā)酵豆粕的總氨基酸表觀消化率在12種飼料原料中是最高的。本實(shí)驗(yàn)黃姑魚肌肉氨基酸分析結(jié)果顯示（表2），在15種氨基酸中，除纈氨酸和蛋氨酸含量沒顯著性差異外，其它氨基酸含量都有差異，且隨著發(fā)酵豆粕替代量的升高呈上升趨勢(shì)。表明飼料中發(fā)酵豆粕部分替代魚粉可以促進(jìn)肌肉中大部分氨基酸的吸收積累，提高黃姑魚肌肉中大部分氨基酸的沉積率。

圖4 不同水平發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肝臟組織形態(tài)的影響Fig.4 The effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on liver tissue morphology of juvenile N.albiflora（HE staining,400×）

3.2 不同水平的發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肝臟和肌肉IGF-I基因的相對(duì)表達(dá)量的影響

IGF-I對(duì)動(dòng)物新陳代謝、生長繁殖和維持神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)作有十分重要的作用[18]，其在動(dòng)物體內(nèi)各組織中均有表達(dá)[19-20]，其中肝臟中表達(dá)量最高[21-23]。研究表明營養(yǎng)狀態(tài)可以影響IGF的合成和分泌[24]，禁食可降低肝臟IGF-I的基因表達(dá)量，而重新給魚投喂食物后IGF-I基因表達(dá)量又隨之上升[25]。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)SM50組肝臟中IGF-I表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（FSM0組），原因可能是隨著發(fā)酵豆粕替代量的增加，飼料適口性較差，降低了黃姑魚幼魚的攝食率，從而降低了肝臟中的IGF-I的表達(dá)量。前人在軍曹魚幼魚Rachycentron canadum[26]、花鱸Lateolabrax japonocus[27]和黃河鯉魚Cyprinus carpio[28-29]飼料研究中發(fā)現(xiàn)植物蛋白添加比例較高時(shí)，肝臟中IGF-I的表達(dá)量較低，這和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是類似的。有趣的是在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃姑魚肌肉中IGF-I表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在FSM30組時(shí)顯著最高。這與肝臟中的IGF-I表達(dá)模式不同，分析原因可能與適量的發(fā)酵豆粕替代魚粉后增加了黃姑魚肌肉中氨基酸的沉積率有關(guān)，具體原因尚待進(jìn)一步研究。

3.3 不同水平發(fā)酵豆粕替代魚粉對(duì)黃姑魚幼魚肝臟組織形態(tài)的影響

過量的植物蛋白替代魚粉會(huì)影響肝功能，當(dāng)肝臟發(fā)生病變，脂蛋白合成減少，使得肝細(xì)胞中的脂肪無法及時(shí)運(yùn)出，造成肝臟脂肪堆積[30-31]。近年來，在對(duì)雜交鱘Acipenser baeri♂×A.schrenkii♀[32]、羅非魚[33]、大黃魚Larimichtys crocea[34]植物蛋白替代魚粉的研究中發(fā)現(xiàn)隨著混合植物蛋白替代魚粉比例升高，肝臟逐漸出現(xiàn)病變，當(dāng)植物蛋白替代魚粉比例過高時(shí)，肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)中黃姑魚肝臟組織學(xué)觀察顯示，F(xiàn)SM0組細(xì)胞排列規(guī)則整齊，細(xì)胞核正常；FSM20組的肝細(xì)胞出現(xiàn)少量空泡化；而FSM50組肝臟細(xì)胞空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞輪廓模糊，部分肝細(xì)胞核已經(jīng)消失不見。這與上述魚種研究結(jié)果相似，過量的發(fā)酵豆粕的添加會(huì)影響肝功能，導(dǎo)致肝臟發(fā)生病變。因此，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意發(fā)酵豆粕的添加量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)酵豆粕替代魚粉可以有效提高黃姑魚魚體中氨基酸的積累（除纈氨酸和蛋氨酸），替代量在20%～30%為宜，否則會(huì)降低肝臟和肌肉中IGF-I的表達(dá)量并造成肝臟損傷。