張 亮，楊 珂，王 冬，王志剛，王 穎，陳雪瑩，趙釹君，姚元志

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所 超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所，重慶 400014；4.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 重慶市腫瘤研究所 重慶市腫瘤醫(yī)院超聲科，重慶 400030)

光動力治療(photodynamic therapy, PDT)依靠光敏劑將吸收到的光能轉(zhuǎn)換給氧氣并產(chǎn)生單線態(tài)氧，從而對靶細胞產(chǎn)生毒性并殺死細胞，達到抗腫瘤治療的目的[1-2]。PDT的療效可因腫瘤部位氧氣供應(yīng)不足而下降[3]，而絕大多數(shù)腫瘤均處于乏氧微環(huán)境中[4]，且PDT治療對氧氣的消耗及造成的血管封閉效應(yīng)也會造成腫瘤部位氧含量進一步降低，影響PDT療效，使得PDT的應(yīng)用受到極大限制[5]。為解決這一難題，本研究以具有良好溶氧性的全氟己烷(Perfluoropentane, PFP)為核心[6]，磷脂雙分子層鑲嵌脂溶性的光敏劑IR780[7]為外殼，制備一種近紅外波段響應(yīng)的相變型自供氧殼核結(jié)構(gòu)納米紅細胞(nano red blood cells， Nano-RBCs)，用于改善腫瘤乏氧微環(huán)境，提高PDT療效。

1 材料與方法

1.1 相變型Nano-RBCs制備 采用一步乳化法制備Nano-RBCs。將12 mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)、4 mg二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-polyethylene glycol 2000， DSPE-mPEG2000)及1 mg IR780碘化物(Sigma公司)溶解于5 ml三氯甲烷(CHCl3)中，55℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除CHCl3成膜，以4 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate Buffer solution， PBS)洗脫磷脂膜，轉(zhuǎn)移至10 ml EP管中。向EP管中加入400 μl PFP(Sigma公司)后，采用Heat System聲振儀于冰浴下聲振3 min(功率100 W,每震5 s停5 s)。于4 ℃下水洗離心3次(轉(zhuǎn)速3 000 rot/min，每次3 min)，以去除未包載的IR780。以PBS重懸至4 ml，置于4 ℃?zhèn)溆?。使用前向重懸液中通入高純?純度≥99%)10 min，即為相變型Nano-RBCs。

1.2 一般性質(zhì)檢測 采用Olympus光學(xué)顯微鏡及Malvern粒徑儀，觀察相變型Nano-RBCs形態(tài)，檢測粒徑大小，并評價其分布情況。以N，N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide， DMF)將IR780溶解至不同濃度(0.38、0.75、1.50、3.00、6.00 μg/ml)，采用Shimadzu UV-2500紫外-可見分光光度計測量其吸收特性，計算IR780的包封率。采用YSI 550A便攜式溶氧儀測量相變型Nano-RBCs在脫氣水中的氧含量。

1.3 體外多模態(tài)成像

1.3.1 超聲顯像 將相變型Nano-RBCs溶于PBS中，配置為不同濃度(125、250、500 μg/ml)的溶液，注入凝膠模型中；采用ADR-1860激光發(fā)射器以808 nm波長激光(強度1.00 W/cm2)輻照不同時間(0、2、4、6 min)。以EC123高頻線陣探頭在基波和諧波模式下觀察凝膠模型中相變型Nano-RBCs超聲顯影情況，并以DFY-Ⅱ型超聲圖像定量分析儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制)分析各靶區(qū)聲強值。

1.3.2 光聲成像 將2 mg/ml相變型Nano-RBCs的PBS溶液加入凝膠模型中，采用Vevo LAZR光聲成像系統(tǒng)進行波長680～970 nm(步長為5 nm)脈沖激光輻照，采集光聲信號，尋找光聲成像的最佳激發(fā)波長。將不同濃度(0.40～2.00 mg/ml)相變型Nano-RBCs的PBS溶液注入凝膠模型中，以最佳激發(fā)波長脈沖激光輻照后，采集光聲圖像并對光聲信號值進行定量分析。

圖1 相變型Nano-RBCs基本表征 A.光鏡下圖像(×1 000)； B.粒徑分布圖； C.不同濃度(0.38、0.75、1.50、3.00、6.00 μg/ml)IR780紫外-可見光的吸收光譜圖； D.相變型Nano-RBCs與脫氣水的釋氧曲線圖

1.3.3 熒光成像 配置濃度為0.13、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml的相變型Nano-RBCs的胎牛血清重懸液，每種濃度分別取100 μl置于96孔板孔洞中。采用IVIS熒光成像系統(tǒng)進行掃描,激發(fā)波長745 nm，發(fā)射波長820 nm，以系統(tǒng)自帶軟件沿各管內(nèi)徑勾畫ROI，測量熒光信號強度。

1.4 相變型Nano-RBCs載氧對PDT的影響 配置不同IR780濃度(1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 μg/ml)的相變型Nano-RBCs及單純IR780的PBS溶液[均含單線態(tài)氧熒光探針(singlet oxygen sensor green， SOSG)，濃度10 μmol/L)],每種濃度溶液設(shè)置3個樣品，置于3 ml比色皿中。以808 nm波長激光(強度1.00 W/cm2)輻照5 min后，采用Spectra Max M2型多功能酶標(biāo)儀測其熒光值，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析比較相變型Nano-RBCs與單純IR780的單線態(tài)氧所致熒光強度的變化。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相變型Nano-RBCs的一般性質(zhì) 制備的相變型Nano-RBCs外觀呈墨綠色的均一圓形(圖1A)，平均粒徑為(372.50±87.30)nm(圖1B)，分散性好[聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index， PDI)為0.10]。紫外吸光譜可見IR780在780 nm處出現(xiàn)最大吸收峰(圖1C)，吸光度隨濃度的增加而增加，在780 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.2671X-0.0298(R2=0.999)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算IR780的包封率為92.50%。體外釋氧曲線示相變型Nano-RBCs可長效釋放大量氧氣(圖1D)。

2.2 相變型Nano-RBCs的體外多模態(tài)成像表現(xiàn) 超聲顯像：相變型Nano-RBCs經(jīng)激光輻照后呈強回聲(圖2A)，定量分析示相變型其基波和諧波回聲強度均隨濃度和輻照時間變化，濃度越高、輻照時間越長，超聲造影效果越好(圖2B)。在680～970 nm波長激光輻照下相變型Nano-RBCs均可表現(xiàn)出光聲信號，波長780 nm處光聲信號最強(圖2C)。光聲顯像：在780 nm波長輻照下，隨相變型Nano-RBCs濃度越高，光聲信號越強(圖2D、2E)，呈線性改變：Y=0.0328X+0.6401(R2=0.9911)。體外熒光成像：隨相變型Nano-RBCs濃度增高，熒光強度增強(圖2F、2G)。

2.3 相變型Nano-RBCs載氧對PDT的增效 在808 nm波長激光輻照下，相變型Nano-RBCs與單純IR780的SOSG熒光強度均隨濃度增高而增大，且包載PFP的相變型Nano-RBCs的SOSG熒光強度較單純IR780明顯增強(P均<0.05，圖3)。

3 討論

PDT是20世紀(jì)70年代末開始形成的一項腫瘤治療技術(shù)[8]，是由光能激發(fā)光敏劑后引起光化學(xué)反應(yīng)來選擇性地破壞腫瘤細胞，具有創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)少、選擇性好、可重復(fù)治療等優(yōu)點[9-10]。其作用基礎(chǔ)是光動力效應(yīng)，這是一種有氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)，主要過程為：以特定波長的光照射使組織吸收的光敏劑受到激發(fā)；激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周圍的氧氣，生成強活性的單線態(tài)氧；單線態(tài)氧與相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細胞毒性作用，進而導(dǎo)致細胞受損乃至死亡[11]。氧對PDT具有重要作用。然而，乏氧微環(huán)境是實體腫瘤的重要特征，多數(shù)實體腫瘤由于細胞代謝旺盛而導(dǎo)致氧含量要遠低于正常組織；此外，在PDT過程中也會消耗氧氣并破壞、封閉血管，進一步加劇腫瘤的乏氧情況，降低PDT的敏感度。目前改善PDT過程中乏氧情況的方法包括：①間斷輻照[12]，在激光輻照的間隙，血供恢復(fù)，供氧增加，但在血管完全破壞后此法無效；②降低輻照功率[13]，雖然可在一定程度上緩解腫瘤組織中氧含量低的問題，但降低輻照功率會使光動力效率隨之降低；③高壓氧艙[14]，能夠有效增加腫瘤組織的氧含量，但持續(xù)高濃度氧氣可引發(fā)一些不良反應(yīng)。

圖2 相變型Nano-RBCs的體外多模態(tài)成像 A、B.不同濃度(125、250、500 μg/ml)相變型Nano-RBCs光致相變后超聲圖像(A)及定量分析圖(B)； C.2 mg/ml相變型Nano-RBCs在680～970 nm波長內(nèi)光聲信號變化； D.不同濃度(0.40～2.00 mg/ml)相變型Nano-RBCs光聲成像圖(D)及定量分析(E)； F、G.不同濃度(0.13、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/ml)相變型Nano-RBCs熒光成像圖(F)及定量分析(G)

PFP是一種具有高溶氧量且安全、可靠的材料[15]。本研究成功制備出包載富氧PFP和光敏劑IR780的相變型Nano-RBCs，不僅可用于體外多模態(tài)顯像，且能實現(xiàn)自供氧以增益PDT。一方面，相變型Nano-RBCs核心PFP能直接、長效地為光敏劑提供氧氣；另一方面，相變型Nano-RBCs能夠在其內(nèi)溶解的氧分子消耗后自發(fā)富集腫瘤組織中的氧氣，以維持光動力反應(yīng)的氧消耗。相變型Nano-RBCs不受腫瘤組織乏氧微環(huán)境的限制，有助于克服PDT光動力反應(yīng)耗氧及血管損傷效應(yīng)的短板。

IR780脂溶性較好，易包裹于脂質(zhì)體的磷脂雙分子層中。本研究采用一步乳化法制備以PFP為核心、磷脂雙分子層和光敏劑為外殼的殼核結(jié)構(gòu)液氣相變型Nano-RBCs，其形態(tài)均一，分散性好，IR780包封率達92.50%，脂質(zhì)體粒徑呈正態(tài)分布，平均粒徑(372.50± 87.30)nm。這種大小的納米?？赏ㄟ^增強滲透與滯留效應(yīng)(enhanced permeation and retention effect， EPR)蓄積到實體腫瘤內(nèi)部。本研究中，紫外吸收光譜顯示IR780在近紅外區(qū)具有強吸收，在780 nm處可見最大吸收峰。此外，本研究發(fā)現(xiàn)相變型Nano-RBCs能長效存儲并釋放大量氧氣，從而增強PDT療效。

圖3 Nano-RBCs載氧對PDT的增效 不同IR780濃度(1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 μg/ml)下經(jīng)激光輻照后相變型Nano-RBCs與單純IR780的SOSG熒光強度對比 (*：P<0.05)

多模態(tài)成像通過不同的影像學(xué)成像方式將圖像進行對比分析，取長補短，獲得更豐富的信息對疾病進行診斷[16]。除本身是一種良好的載氧體外，PFP所構(gòu)建的液氣相變型納米粒也可作為超聲分子探針，在超聲顯像和治療中發(fā)揮重要作用[17-18]。本研究多模態(tài)成像中，超聲顯像結(jié)果顯示，在激光輻照下PFP可發(fā)生液氣相變，其回聲強度隨濃度和輻照時間增加而增強，不僅表明脂質(zhì)體成功包裹PFP，還表明相變型Nano-RBCs可作為超聲造影劑完成對腫瘤的示蹤。IR780是一種近紅外光敏劑，亦可產(chǎn)生光聲信號。本研究體外光聲顯像實驗中，光聲信號值在780 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，與紫外吸收光譜一致，且光聲信號隨相變型Nano-RBCs濃度增高而增強，表明IR780被成功包載，相變型Nano-RBCs可用于光聲成像。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，隨相變型Nano-RBCs濃度增高，體外熒光成像的熒光強度逐漸越強。本研究結(jié)果顯示，激光輻照下相變型Nano-RBCs及單純IR780的SOSG熒光強度均隨濃度增高而增大，且相變型Nano-RBCs的SOSG熒光強度明顯高于單純IR780，表明二者均可隨濃度增高而產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧，且相變型Nano-RBCs的單線態(tài)氧產(chǎn)量更高。

本研究成功制備出一種能夠攜氧的近紅外響應(yīng)、可光致相變的納米級紅細胞，并通過體外實驗證實其可用于超聲/光聲/熒光三模態(tài)成像，并具有體外增效PDT的功能，有望為多模態(tài)顯像引導(dǎo)腫瘤治療的發(fā)展提供新的思路。