維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)非特異性免疫及抗氧化能力的影響

秦國(guó)兵，熊 偉，姚俊杰，楊通枝，賈美香

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

匙吻鱘(Polyodonspathula)俗稱鴨嘴鱘，是一種古老的大型淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。在魚(yú)苗培育過(guò)程中，常常面臨水體環(huán)境突變脅迫問(wèn)題，導(dǎo)致培育期間仔魚(yú)死亡率增大。匙吻鱘仔魚(yú)孵化出膜后，1～5 d內(nèi)營(yíng)養(yǎng)全部依靠卵黃，這個(gè)時(shí)期是內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期。仔魚(yú)在第6天左右才開(kāi)始攝食，開(kāi)口攝食初期，體內(nèi)卵黃囊仍未完全消失，營(yíng)養(yǎng)來(lái)自卵黃和外源食物，這個(gè)時(shí)期是混合營(yíng)養(yǎng)期?；旌蠣I(yíng)養(yǎng)期是仔魚(yú)從內(nèi)源的卵黃營(yíng)養(yǎng)向外源的餌料營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)變的過(guò)渡時(shí)期，是魚(yú)類(lèi)早期發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，在此期未能成功轉(zhuǎn)食的仔魚(yú)即會(huì)大量死亡。

維生素C(Vc)是一種水溶性抗氧化劑，可清除氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，是動(dòng)物生長(zhǎng)和維持正常生理機(jī)能所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)在促進(jìn)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、提高抗病能力、緩解應(yīng)激脅迫和創(chuàng)傷愈合方面有明顯作用[1]。相關(guān)研究表明，維生素C能提高仔魚(yú)免疫和總抗氧化能力(T-AOC)，并降低丙二醛(MDA)含量[2-3]。亞硝酸鹽脅迫下，飼料中添加維生素C對(duì)異育銀鯽的堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)活性及T-AOC有改善作用[4-5]。同時(shí)，維生素C可增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物抗低溫[6]、酸[7]、鹽度[8]、氨氮[9-10]、有機(jī)磷農(nóng)藥[11]和重金屬[12]等脅迫能力，都與其能夠提高機(jī)體T-AOC有著密切關(guān)系。目前，亞硝酸鹽的急性毒性作用在很多種魚(yú)上已被研究[13-16]，但關(guān)于亞硝酸鹽脅迫下，水體中添加不同質(zhì)量濃度維生素C是否能在一定程度上緩解其對(duì)匙吻鱘仔魚(yú)的脅迫作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在揭示匙吻鱘仔魚(yú)在亞硝酸鹽脅迫下，不同質(zhì)量濃度維生素C對(duì)其脅迫的緩解作用，以期為匙吻鱘魚(yú)苗早期培育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)匙吻鱘來(lái)自貴州羅甸縣匙吻鱘養(yǎng)殖基地，平均體質(zhì)量為(0.051 4±0.001 0)g，平均體長(zhǎng)(11.907±0.552)mm。在塑料箱(60 cm×43 cm×35 cm)中進(jìn)行試驗(yàn)，置于水深30 cm處。內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期的匙吻鱘仔魚(yú)為出膜1～5日齡仔魚(yú)，混合營(yíng)養(yǎng)期為6～11日齡仔魚(yú)。試驗(yàn)期間，平均水溫18.5 ℃，pH值6～7，溶氧量>5 mg/L。亞硝酸鹽測(cè)試盒購(gòu)自上海澤芮化學(xué)科技有限公司，酶活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

參考譚樹(shù)華等[13]研究，設(shè)置亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0.5 mg/L。本研究設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，1 000尾/箱。對(duì)照組中不添加亞硝酸鹽及維生素C；處理組試驗(yàn)用水均含質(zhì)量濃度為0.5 mg/L亞硝酸鹽，除脅迫組外，在其余4個(gè)處理組中又分別添加30、60、90、120 mg/L 維生素C。每隔1 h用亞硝酸鹽測(cè)試盒檢測(cè)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度，低于0.5 mg/L時(shí)，加入先配好的亞硝酸鹽，保證其質(zhì)量濃度不變，期間換亞硝酸鹽及維生素C溶液溫差不超過(guò)1 ℃。取樣時(shí)間是亞硝酸鹽脅迫后12、24、48、72 h，本研究的12 h和24 h取樣時(shí)間為仔魚(yú)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期，48 h和72 h為混合營(yíng)養(yǎng)期，取仔魚(yú)整體保存在-20 ℃，用于LZM、ACP、AKP活性，T-AOC，MDA含量的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件處理，進(jìn)行方差分析(One-way ANOVA)和多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)不同發(fā)育階段LZM活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對(duì)仔魚(yú)LZM活性影響見(jiàn)圖1。在同一取樣時(shí)間下，12 h和24 h的LZM隨維生素C質(zhì)量濃度的增加，呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組顯著高于脅迫組(P<0.05)，在48 h和72 h，LZM活性呈現(xiàn)“升高—降低”趨勢(shì)，且90 mg/L 維生素C添加組LZM活性均顯著高于脅迫組(P<0.05)。90 mg/L 維生素C添加組的LZM活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為71.8%。

不同小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間不同試驗(yàn)組間差異顯著(P<0.05)， 不同大寫(xiě)字母表示相同試驗(yàn)組從內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期到混合營(yíng)養(yǎng)期 顯著上升(P<0.05)，下同圖1 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)LZM活性的影響

2.2 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)不同發(fā)育階段AKP活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對(duì)仔魚(yú)AKP活性影響見(jiàn)圖2。在相同取樣時(shí)間下，12 h和24 h的AKP活性隨維生素C質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且除24 h時(shí)90 mg/L維生素C添加組與對(duì)照組差異不明顯外；其他90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組均顯著高于對(duì)照組和脅迫組(P<0.05)。在48 h和72 h，AKP活性呈現(xiàn)“升高—降低”趨勢(shì)，且90 mg/L維生素C添加組顯著高于脅迫組(P<0.05)。90 mg/L維生素C添加組的AKP活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為33.7%。

圖2 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)AKP活性的影響

2.3 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)不同發(fā)育階段ACP活性的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對(duì)仔魚(yú)ACP活性影響見(jiàn)圖3。在相同取樣時(shí)間下，12 h和24 h的ACP活性隨維生素C質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，且90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組顯著高于對(duì)照組和脅迫組(P<0.05)。在48 h和72 h，ACP活性呈現(xiàn)“升高—降低”趨勢(shì)，且90 mg/L維生素C添加組顯著高于對(duì)照組和脅迫組(P<0.05)。90 mg/L維生素C添加組的ACP活性從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率為48.4%。

圖3 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)ACP活性的影響

2.4 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)不同發(fā)育階段T-AOC的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對(duì)仔魚(yú)T-AOC影響見(jiàn)圖4。在同一取樣時(shí)間下，T-AOC隨維生素C質(zhì)量濃度的增加，均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，脅迫組的T-AOC在12 h和24 h無(wú)顯著差異(P>0.05)，在48 h和72 h顯著降低(P<0.05)。90 mg/L和120 mg/L維生素C添加組的T-AOC從24 h至48 h顯著上升(P<0.05)，上升率分別為61.1%和43.9%。

2.5 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)不同發(fā)育階段MDA含量的影響

亞硝酸鹽脅迫下維生素C對(duì)匙吻鱘仔魚(yú)MDA含量影響見(jiàn)圖5。脅迫組的MDA含量均顯著高于維生素C添加組和對(duì)照組(P<0.05)，且不論是內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期還是外源營(yíng)養(yǎng)期，相同取樣時(shí)間下，隨著維生素C質(zhì)量濃度的升高，MDA含量均呈下降趨勢(shì)。如圖5可知，120 mg/L 維生素C添加組的MDA含量最低，比脅迫組和對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，12～72 h下降率分別為40.3%、62.2%、69.9%、37.4%與26.3%、17.6%、18.0%、6.3%，維生素C添加組MDA含量從24 h至48 h無(wú)顯著變化(P>0.05)。

圖5 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)MDA含量的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期及混合營(yíng)養(yǎng)期LZM、AKP、ACP活性影響

魚(yú)類(lèi)早期發(fā)育生長(zhǎng)中，由于其免疫器官還未分化發(fā)育成熟，此階段抵抗外界病原微生物主要依賴于非特異性免疫和母源性免疫[17]，在非特異免疫應(yīng)答中LZM、AKP、ACP發(fā)揮著重要作用[18-19]，其活性能夠反映仔魚(yú)的免疫力，非特異性免疫能力低是引起仔魚(yú)死亡的原因之一。匙吻鱘仔魚(yú)在自然生長(zhǎng)條件下，內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期到混合營(yíng)養(yǎng)期，AKP、ACP活性顯著增加，可能是此階段仔魚(yú)腸道發(fā)育逐漸完善，腸道細(xì)胞需要更多的磷酸酶對(duì)大分子物質(zhì)進(jìn)行吸收。LZM作為非特異性防御機(jī)制的第一道防線，其主要功能是消化和防御，不同物種中LZM的功能不同，這是由其基因結(jié)構(gòu)決定的。當(dāng)仔魚(yú)受到外界刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)的LZM在不同組織的表達(dá)量出現(xiàn)一定的變化，來(lái)應(yīng)對(duì)這些脅迫作用。匙吻鱘仔魚(yú)從內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期到混合營(yíng)養(yǎng)期LZM活性顯著升高，說(shuō)明仔魚(yú)在開(kāi)口攝食后，外源餌料生物會(huì)刺激LZM相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高其活性。

匙吻鱘仔魚(yú)隨著日齡的增長(zhǎng)，受亞硝酸鹽的脅迫逐漸加深。亞硝酸鹽毒性效應(yīng)與質(zhì)量濃度、暴露時(shí)間、魚(yú)的種類(lèi)、魚(yú)體大小及年齡等密切相關(guān)[20]，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，亞硝酸鹽會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而抑制免疫酶的合成和分泌。相關(guān)研究表明，亞硝酸鹽脅迫會(huì)降低磷酸酶和LZM活性[21]，同時(shí)升高魚(yú)體內(nèi)ROS水平，進(jìn)而對(duì)機(jī)體免疫力產(chǎn)生一定的抑制作用。維生素C作為一種重要的免疫增強(qiáng)劑，能進(jìn)入卵黃囊仔魚(yú)體內(nèi)，可以提高吞噬細(xì)胞的吞噬活性和殺傷力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和特異性抗體的產(chǎn)生。本研究匙吻鱘仔魚(yú)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期，受亞硝酸鹽脅迫下，隨維生素C質(zhì)量濃度的增加，仔魚(yú)LZM、AKP、ACP活性增加，說(shuō)明維生素C能夠提高匙吻鱘仔魚(yú)非特異性免疫功能，在相關(guān)研究結(jié)果中也得到了證實(shí)[4]。在混合營(yíng)養(yǎng)期，LZM、AKP、ACP活性顯著升高，表明仔魚(yú)開(kāi)口攝食后，其各項(xiàng)生理機(jī)能開(kāi)始不斷完善，此時(shí)既可以從卵黃吸收營(yíng)養(yǎng)又可以從餌料中獲得，使免疫防御不斷加強(qiáng)；另一方面，說(shuō)明維生素C進(jìn)入匙吻鱘仔魚(yú)體內(nèi)，不僅有解毒功能，同時(shí)可消除亞硝酸鹽脅迫帶來(lái)的ROS，進(jìn)而提高仔魚(yú)機(jī)體非特異性免疫防御。

3.2 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘仔魚(yú)內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期及混合營(yíng)養(yǎng)期T-AOC的影響

在匙吻鱘仔魚(yú)自然生長(zhǎng)中，隨日齡的增長(zhǎng)，T-AOC逐漸增加。其中在內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期，上升不明顯，而到了混合營(yíng)養(yǎng)期顯著升高。少量ROS是生物體所必需的，但過(guò)多的ROS如果不能被及時(shí)清除，它們將會(huì)攻擊各種生物大分子，引起生物體各種生理病變。在匙吻鱘仔魚(yú)不斷發(fā)育過(guò)程中，其各項(xiàng)生理機(jī)能不斷完善，在開(kāi)口攝食后，機(jī)體代謝加強(qiáng)，使得耗氧率不斷增加，產(chǎn)生的ROS越來(lái)越多，為保證機(jī)體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體必須清除過(guò)多的ROS。此時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。本研究中隨仔魚(yú)的發(fā)育，T-AOC不斷升高，說(shuō)明仔魚(yú)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)逐步發(fā)育完善，在相關(guān)研究中已得到證實(shí)[21]。

匙吻鱘仔魚(yú)隨日齡的增長(zhǎng)，T-AOC受亞硝酸鹽脅迫的影響逐漸降低。內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期，T-AOC受影響較大；混合營(yíng)養(yǎng)期受影響較小。亞硝酸鹽脅迫使仔魚(yú)血液中亞鐵蛋白氧化成高鐵紅蛋白，并通過(guò)呼吸作用來(lái)改變內(nèi)臟器官的皮膜通透性，滲透調(diào)節(jié)失調(diào)，進(jìn)而阻礙細(xì)胞分化，導(dǎo)致仔魚(yú)畸形或死亡[22]，使免疫機(jī)能降低。同時(shí)，亞硝酸鹽脅迫會(huì)使魚(yú)機(jī)體非特性免疫及抗氧化能力下降[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨維生素C質(zhì)量濃度的增加，內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)T-AOC逐漸升高，MDA含量顯著降低，表明亞硝酸鹽脅迫下，水中添加適宜的維生素C可以提高匙吻鱘內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)T-AOC。而在混合營(yíng)養(yǎng)期，維生素C組T-AOC與脅迫組差異明顯，且隨維生素C質(zhì)量濃度的增加出現(xiàn)升高現(xiàn)象，表明一方面混合營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)對(duì)低質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽的耐受力逐漸增強(qiáng)；另一方面，可能在此階段仔魚(yú)除了從水體中獲得維生素C外，也從攝食的餌料中獲得，使得仔魚(yú)體內(nèi)維生素C含量增加，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.3 90 mg/L 維生素C對(duì)亞硝酸鹽脅迫下匙吻鱘內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期及混合營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)的保護(hù)

不同質(zhì)量濃度維生素C對(duì)魚(yú)類(lèi)在抗環(huán)境脅迫方面有重要作用[2,24]，維生素C 可以通過(guò)發(fā)揮抗氧化功能來(lái)阻止多不飽和脂肪酸過(guò)氧化，避免細(xì)胞膜遭受氧化損傷，提高魚(yú)體的免疫力和抗病力。不同魚(yú)類(lèi)的卵黃囊期仔魚(yú)，用不同質(zhì)量濃度維生素C浸泡有不同作用效果[25]。

在亞硝酸鹽脅迫下，本研究用不同質(zhì)量濃度維生素C溶液浸泡內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)，90 mg/L、120 mg/L維生素C組LZM、AKP、ACP活性及T-AOC顯著高于脅迫組和對(duì)照組，說(shuō)明匙吻鱘仔魚(yú)在內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期，外源添加維生素C質(zhì)量濃度越高，仔魚(yú)機(jī)體抗環(huán)境脅迫越強(qiáng)。剛出膜仔魚(yú)，沒(méi)有卵膜的保護(hù)，對(duì)不良環(huán)境敏感性下降，水體中直接添加可溶性維生素C，其小分子結(jié)構(gòu)可以通過(guò)魚(yú)呼吸器官吸收，能夠進(jìn)入仔魚(yú)體內(nèi)，維持魚(yú)體正常生理機(jī)能。而在仔魚(yú)混合營(yíng)養(yǎng)期，120 mg/L 維生素C組雖顯著降低了ROS對(duì)機(jī)體的氧化損傷，但同時(shí)也降低了LZM、AKP、ACP活性，說(shuō)明高質(zhì)量濃度維生素C溶液抑制了匙吻鱘混合營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)的非特異性免疫酶活性，這可能是不同發(fā)育時(shí)期，不同魚(yú)類(lèi)對(duì)維生素C代謝率不同，從而導(dǎo)致維生素C需要量的差異，使維生素C對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫力作用的形式也不同。綜合考慮實(shí)際養(yǎng)殖情況及本研究維生素C添加組對(duì)匙吻鱘內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)期和混合營(yíng)養(yǎng)期仔魚(yú)LZM、AKP和ACP的影響情況，亞硝酸鹽脅迫下，90 mg/L維生素C對(duì)匙吻鱘仔魚(yú)的保護(hù)效果較好。