吳保義， 陳正鵬， 李紅旺， 金春梅， 梁晚?xiàng)鳎?于龍政

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

犬新孢子蟲(Neosporacaninum)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原生動物寄生蟲，主要寄生于犬、牛、羊等多種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[1]。犬新孢子蟲侵入過程復(fù)雜，是多個蛋白質(zhì)分子參與調(diào)控機(jī)制以及宿主細(xì)胞內(nèi)多個因子相互作用而完成的。該過程包括蟲體對宿主細(xì)胞的識別和依附，入侵宿主細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)建立納蟲空泡并分裂增殖，納蟲空泡破裂蟲體釋放，再次入侵新的細(xì)胞。

酵母雙雜交技術(shù)主要是基于對酵母菌轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究設(shè)計(jì)而成，1989年由Fields等提出并初步建立[2]。該技術(shù)靈敏度非常高，目前在很多蛋白間關(guān)系鑒定試驗(yàn)中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[3]。Liu Q等[4]以TgGRA15為誘餌，將TgGRA15克隆到pGBKT7載體中并在Y2HGold酵母菌株中表達(dá)，篩選酵母雙雜交cDNA文庫，首次揭示了與TgGRA15相互作用的新的宿主細(xì)胞蛋白。新孢子蟲致密顆粒蛋白(dense granules proteins, GRAs)對納蟲空泡的形成及其功能的發(fā)揮具有重要作用。

本研究為了篩選出與新孢子蟲致密顆粒NcGRA7蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，構(gòu)建并鑒定了誘餌載體pGBKT7-NcGRA7。

1 材料與方法

1.1 試劑

新孢子蟲Nc-1株，pGBKT7，pMD-19T(Simple)，DH5α保存于延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，DNA提取試劑盒，質(zhì)粒DNA提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及EcoRⅠ、SalⅠ均購買于TaKaRa公司。2×Taq Master Mix購自北京佳蘭生物科技有限公司

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的新孢子蟲GRA7的基因序列，應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF，在華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 新孢子蟲基因組DNA提取

將保存的蟲株復(fù)蘇并接種于Vero細(xì)胞，培養(yǎng)2～3 d，觀察到速殖子后根據(jù)TaKaRa公司DNA提取試劑盒提取新孢子蟲株的基因組DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增NcGRA7基因

以提取的新孢子蟲株的DNA為模板，PCR體系為20 μL：NcGRA7-ES-fullR，NcGRA7-EN-commonF各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板 2 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1.5 pMD-19T(simple)-NcGRA7構(gòu)建

將擴(kuò)增出的目的片段用膠回收試劑盒進(jìn)行回收后與pMD-19T(simple)連接，連接體系：NcGRA7 PCR產(chǎn)物 4.5 μL，pMD-19T (Simple)0.5 μL，Ligation SolutionⅠ5 μL。16 ℃連接12 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后涂布于Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，挑取單個菌落接種到Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)過酶切鑒定后，陽性質(zhì)粒送往生物公司測序，測序正確將其命名為pMD-19T(simple)-NcGRA7。

1.6 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7的構(gòu)建

將測序成功的pMD-19T(simple)-NcGRA7質(zhì)粒以及pGBKT7載體用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收后，使用T4連接酶16 ℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于Kan抗性的LB固體培養(yǎng)基，經(jīng)過挑菌，搖菌及酶切鑒定后將陽性質(zhì)粒送往生物公司測序。

1.7 NcGRA7基因的序列比對

應(yīng)用分子生物學(xué)軟件GENETYX對測序后的NcGRA7基因序列與GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因進(jìn)行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR結(jié)果

以新孢子蟲Nc-1株的DNA為模板，以NcGRA7-ES-fullR和NcGRA7-EN-commonF為引物擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到約570 bp片段，與預(yù)期大小一致(圖1)。

M：DL 2 000 Marker；1：擴(kuò)增產(chǎn)物；2：空白對照

2.2 pMD-19T(simple)-NcGRA7酶切鑒定

將NcGRA7的PCR產(chǎn)物與pMD-19T(simple)連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)過PCR初步鑒定后，用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，質(zhì)粒切出目的條帶約為570 bp，與預(yù)期大小一致(圖2)。

圖2 pMD19T-NcGRA7質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7的酶切鑒定

用EcoRⅠ和SalⅠ分別對pMD-19T-NcGRA7以及pGBKT7進(jìn)行雙酶切，膠回收后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化。經(jīng)過PCR初步鑒定后得到陽性質(zhì)粒，再進(jìn)一步酶切鑒定，對陽性進(jìn)行雙酶切，得到與之前一致的約570 bp大小片段(圖3)。

圖3 pGBKT7-NcGRA7質(zhì)粒酶切鑒定

2.4 NcGRA7基因的序列比對分析

將去掉信號肽和疏水區(qū)的NcGRA7基因測序后，和GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明，試驗(yàn)所獲得的NcGRA7基因與GenBank中(登錄號：U82229)NcGRA7基因同源性100%(圖4)，可用于后續(xù)研究。

3 討論與結(jié)論

利用酵母雙雜交系統(tǒng)可以從cDNA文庫和基因文庫中篩選出與構(gòu)建的誘餌載體所表達(dá)蛋白相互作用的蛋白，以此來得到相關(guān)的受體，并進(jìn)一步繪制出蛋白質(zhì)相互作用圖譜，可以增加對入侵機(jī)理的了解[5]。該試驗(yàn)研究的NcGRA7基因序列中無內(nèi)含子，其含有1個信號肽序列和1個跨膜區(qū)[6]，NcGRA7蛋白是一種新孢子蟲速殖子，其特異性表達(dá)的致密顆?？乖璠7]，相對分子質(zhì)量約為33 ku，該蛋白中包括3個疏水區(qū)，其中，第3個疏水區(qū)是跨膜區(qū)，表明了NcGRA7對空泡的形成和膜的表面修飾起到一定的作用。NcGRA7蛋白在1998年由Jacobs等篩選得到[8]。Huang等通過ELISA鑒定得出NcGRA7可能在寄生蟲誘導(dǎo)的流產(chǎn)中起作用[9]。Jenkins等通過質(zhì)粒DNA免疫研究證實(shí)了NcGRA7可以作為免疫原[10]。但目前對NcGRA7蛋白的具體功能缺乏了解。

為篩選出與NcGRA7相互作用的蛋白，進(jìn)一步探索新孢子蟲入侵機(jī)理和制備疫苗，該試驗(yàn)構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體。鑒于pMD19T(Simple)載體連接條件簡便、連接效率高，試驗(yàn)將NcGRA7基因先與pMD19T(Simple)連接，獲得兩端有EcoRⅠ、SalⅠ黏性末端的NcGRA7基因后，再連接到pGBKT7載體上。

本試驗(yàn)通過提取新孢子蟲Nc-1株的DNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到NcGRA7基因，并將其克隆到pMD19T(simple)載體。經(jīng)過測序以及序列分析鑒定，與NCBI基因庫中的NcGRA7基因序列比對結(jié)果一致。再將得到的目的基因克隆到pGBKT7載體上，成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NcGRA7，為后續(xù)試驗(yàn)酵母雙雜交鑒定奠定基礎(chǔ)。

圖4 NcGRA7基因的核苷酸序列比對