殷婷婷

（齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353）

1 油菜多倍體誘導(dǎo)技術(shù)概述

油菜是十字花科植物，顏色深綠，一年生草本，直根系，莖直立，分枝較少，株高30～90 cm，葉互生，分基生葉和莖生葉兩種。多倍體育種已在觀賞花卉和蔬菜作物上得到廣泛應(yīng)用，如多倍體蔬菜常見的有無籽西瓜、黃瓜、白菜、辣椒等，多倍體花卉中常見有矮牽牛、君子蘭、紫茉莉等[1]。油菜作為主要的油料作物，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值都很高。因此，油菜的多倍體的誘導(dǎo)具有重要的意義。

多倍體植株一般具有植株粗壯、葉片肥大、花器官大、花色嬌艷、耐儲(chǔ)藏運(yùn)輸[2]；生長勢(shì)強(qiáng)、分枝減少、生育期延長；種子增大、結(jié)實(shí)率降低；氨基酸、還原糖、維生素及礦物質(zhì)含量增加；有機(jī)營養(yǎng)成分增多等優(yōu)點(diǎn)[3]，因此,研究多倍體誘導(dǎo)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中具有重要意義。自然界中獲得多倍體的過程很漫長，為此常用人工誘導(dǎo)的方法獲得多倍體植株，分為化學(xué)方法和物理方法。物理方法包括各種射線、溫度異變、調(diào)整離心力、機(jī)械創(chuàng)傷等，其誘變效率太低，重復(fù)性差，很難在實(shí)踐中得到應(yīng)用，因而在多倍體的誘導(dǎo)研究中往往采用化學(xué)方法，誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥品有很多，主要有秋水仙素、氯乙醛、笑氣、富民等，其中秋水仙素被廣泛采用[2]。秋水仙素是微管特異性藥物，主要作用是抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，阻止染色體移向兩級(jí)移動(dòng)，停留在分裂中期，細(xì)胞不能繼續(xù)分裂，從而產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)分裂，產(chǎn)生多倍體植株[4]。

秋水仙素對(duì)不同植物的作用存在差異，有研究表明，一般秋水仙素的有效濃度在0.01%～0.4%，而以0.2%左右的濃度為最常用。在實(shí)際應(yīng)用中，0.2%的濃度常設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)濃度，向上或向下篩選合適的濃度。利用秋水仙素處理材料的時(shí)間一般大于24 h，據(jù)報(bào)道處理時(shí)間一般為2～6 d，但濃度很低時(shí)處理時(shí)間有的會(huì)長達(dá)30 d?？傊幚頋舛雀邥r(shí)，處理時(shí)間可能會(huì)相應(yīng)縮短；反之，處理時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長。處理溫度一般為18～25℃，此溫度下細(xì)胞分裂與植物生長旺盛，處理效果較好[5]。

秋水仙素處理材料的方法有：浸漬法、滴液法、涂抹法、注射法。其中浸漬法簡單易行，便于操作，誘導(dǎo)效率高[6]。運(yùn)用秋水仙素溶液直接浸泡種子的方法已成功的在菊花腦、小白菜、君子蘭[7-9]等植物上誘導(dǎo)出了多倍體。借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)即采用了浸種法并期望獲得多倍體植株，以期為下一步多倍體植物育種奠定一定的研究基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料及試劑 試驗(yàn)用材料為市售的油菜種子，秋水仙素、無水乙醇、冰醋酸、卡諾氏固定液、5 mol/L鹽酸、45%醋酸、1%龍膽紫以及Hoagland營養(yǎng)液。

2.2 油菜種子處理 本試驗(yàn)采用浸種法，選取籽粒飽滿的油菜種子。先用蒸餾水浸泡12 h，催根、芽萌動(dòng)后倒掉水分，種子用0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的秋水仙素溶液分別進(jìn)行12 h、24 h、48 h浸泡處理(浸沒種子的2/3)，由于秋水仙素溶液見光易分解，因此在處理時(shí)放置黑暗處。另有一組為對(duì)照組，浸在蒸餾水中處理相同時(shí)間。藥物處理結(jié)束后，取出種子，用蒸餾水沖洗種子及根2～3次去除殘留的秋水仙素。將萌發(fā)種子移到裝有Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中25 ℃光照培養(yǎng)，每天光照14 h，培養(yǎng)發(fā)芽。根尖長到1～2 cm，選取健壯根尖將根尖固定后保存于70%乙醇中，用于觀察染色體加倍情況。

2.3 形態(tài)變異率統(tǒng)計(jì) 5 d后，以根莖部位明顯變短、膨大作為形態(tài)變異指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)變異株占總苗數(shù)的百分率。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 7 d后，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組植株的株高，每組隨機(jī)選取10株健壯的植株進(jìn)行株高測(cè)量。其中，株高為自植株基部到頂端的自然高度。取對(duì)照和多倍體植株葉片的同一部位觀察氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的變化。

2.5 細(xì)胞學(xué)觀察 取出早期保存于70%乙醇中的根尖，投入卡諾氏固定液（現(xiàn)用現(xiàn)配）中固定(30 min)，將固定好的根尖用蒸餾水沖洗2次放入5 mol/L鹽酸中處理5～10 min，當(dāng)根尖的伸長區(qū)變透明而分生區(qū)呈乳白色時(shí)即可取出。將解離好的材料用蒸餾水沖洗后，轉(zhuǎn)入45%醋酸中軟化10 min。將軟化好的根尖放在載玻片上，用刀片切去伸長區(qū)，只留下1～2 mm的分生區(qū)。滴1滴龍膽紫染色液染色3～5 min。染色完畢后用吸水紙吸去多余的染液并用蒸餾水沖洗，然后將材料移至另一清潔的載玻片上，覆以蓋玻片，以鉛筆的橡皮頭端輕輕敲打蓋玻片，使材料呈現(xiàn)分散的薄層，置光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察。

3 結(jié)果與分析

3.1 秋水仙素對(duì)油菜的誘變效應(yīng) 以植株根莖部粗大作為形態(tài)變異指標(biāo)，由表1可知，秋水仙素濃度相同時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長，死亡率隨之增高，說明處理時(shí)間越長，秋水仙素對(duì)種子的毒害就越大。處理時(shí)間相同時(shí)，隨著處理濃度的變大，死亡率隨之增高，表明處理濃度越大，秋水仙素對(duì)種子的毒害也越大。由誘變率可知，雖然0.4%的濃度處理油菜48 h變異率為86.7%，但由于死亡率為63.3%遠(yuǎn)大于0.2%的濃度處理24 h的13.3%，效果欠佳。因此，油菜以0.2%秋水仙素處理24 h誘導(dǎo)效果最佳，誘變率為63.3%。

表1 不同濃度秋水仙素和處理時(shí)間對(duì)油菜的誘導(dǎo)效果

3.2 秋水仙素對(duì)油菜株高的影響 對(duì)照播種后第2 d開始出苗，而且出苗一致，到第3 d大致出齊，而經(jīng)秋水仙素處理過的種子出苗則相應(yīng)延遲，生長速度明顯遲緩，根部粗短，莖增粗，子葉加厚，葉片濃綠且發(fā)亮，葉片皺縮。說明經(jīng)秋水仙素對(duì)萌動(dòng)中的種子有一定的毒害作用（如圖1所示）。

由圖1可以看出，同一濃度的秋水仙素隨著處理時(shí)間的延長對(duì)油菜株高的抑制作用越來越明顯。同一處理時(shí)間相同的情況下，株高隨著秋水仙素濃度的遞增呈現(xiàn)一個(gè)下降的趨勢(shì)，說明無論是低濃度還是高濃度的秋水仙素對(duì)株高均呈現(xiàn)抑制作用。

3.3 油菜多倍體鑒定 在光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察對(duì)照及變異油菜葉片的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞，結(jié)果顯示加倍后的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞明顯變大（圖2，a、b）。采用根尖壓片對(duì)變異植株和二倍體植株分別進(jìn)行染色體鑒定。光學(xué)顯微鏡（1 000倍）下觀察，可見與對(duì)照植株相比，變異植株染色體數(shù)明顯加倍（圖2，c、d）。

圖1 不同秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)油菜株高的影響

圖2 二倍體與多倍體的染色體和氣孔比較（a、c：二倍體；b、d：多倍體）

4 討論與結(jié)論

多倍體育種中秋水仙素仍然是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)試劑之一，研究表明，多倍體誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵因素是把握好秋水仙素的濃度以及處理時(shí)間。濃度過低以及處理時(shí)間過短都難以取得理想的誘變效果，而高濃度的秋水仙素或處理的時(shí)間過長都會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生毒害作用[10]。通過秋水仙素誘導(dǎo)獲得的油菜變異株：植株粗壯，葉片增厚，葉片深綠，保衛(wèi)細(xì)胞增大，植物生長速度緩慢，這些表現(xiàn)基本同一般多倍體變異一致[11]。因此，在多倍體誘導(dǎo)過程中，可以將形態(tài)及氣孔特征的變異作為篩選多倍體的初步鑒定指標(biāo)，在此基礎(chǔ)上通過染色體的鑒定進(jìn)一步確定變異植株，這樣可以簡化操作過程，縮短工作時(shí)間。本試驗(yàn)采用了秋水仙素溶液浸泡種子法，研究了不同濃度相同處理時(shí)間對(duì)植物倍性的影響，并通過形態(tài)觀察、氣孔觀察、染色體鑒定方法對(duì)多倍體的初步特征進(jìn)行了研究。試驗(yàn)得出誘導(dǎo)油菜的最佳組合是0.2%秋水仙素處理24 h。此研究結(jié)果對(duì)下一步多倍體油菜育種奠定了一定的研究基礎(chǔ)。