張 宇 呂鵬博 錢鑫慧 張博文 白素英

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

麝鼠(Ondatrazibethicus)又稱青根貂，20世紀50年代末引入中國。成年的雄性麝鼠下腹部背皮與肌肉間有一對香腺，繁殖期(每年3～10月)時能夠分泌麝鼠香[1]。麝鼠香的藥理作用與天然麝香相近，具有成為天然麝香替代品的巨大潛力，具有很高的經(jīng)濟價值。目前，麝鼠的相關(guān)研究尚處于初級階段，大多集中于組織形態(tài)學(xué)觀察、分類與進化、毛皮和麝鼠香的藥用價值等方面，對麝鼠香腺發(fā)育調(diào)節(jié)的研究有待深入。細胞自噬泛指溶酶體介導(dǎo)的細胞自身降解過程，借以維持細胞本身的代謝需要和對某些細胞器的更新[2]。自噬體是由單層或雙層膜包裹待降解物所形成，其出現(xiàn)是自噬過程中的關(guān)鍵階段，自噬系統(tǒng)的平衡對維持機體正常生理狀態(tài)起到重要調(diào)節(jié)作用[3]。細胞自噬的分子機制中涉及多種自噬相關(guān)蛋白，Atg9(autophagy-related protein 9，自噬相關(guān)蛋白9)是其中唯一的跨膜蛋白。自噬過程中Atg9蛋白在外周膜與PAS(pre-autophagosomal structure，自噬前體結(jié)構(gòu)，為自噬體組裝位點)間往返循環(huán)，因此Atg9被認為可能具有“膜載體”的作用，對自噬體形成具有重要意義。Atg9由PAS返回外周膜的過程稱為Atg9的逆向運輸，目前公認的觀點是Atg2-Atg18復(fù)合體與Atg9蛋白相互作用，促使Atg9蛋白逆向運輸?shù)陌l(fā)生[4]。因此Atg2和Atg9基因的轉(zhuǎn)錄水平可以從一定程度上反應(yīng)細胞發(fā)生自噬的程度[5-6]。本研究以此為切入點，通過熒光定量PCR技術(shù)比較麝鼠Atg2a和Atg9b基因在香腺繁殖期與非繁殖期的轉(zhuǎn)錄水平差異，并探討麝鼠香腺的發(fā)育與細胞自噬之間的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

分別于4月末(繁殖期)和10月末(非繁殖期)于哈爾濱市呼蘭區(qū)麝鼠養(yǎng)殖場購買體況相近的1歲齡成年雄性麝鼠共計6只，繁殖期3只，非繁殖期3只。將麝鼠保定后乙醚吸入麻醉，采集左右兩側(cè)香腺并立即投入液氮中速凍，后轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

將上述組織于液氮下快速研磨，利用RNA提取試劑盒(thermo scientific，USA)提取總RNA。利用DNase I消化總RNA中的DNA殘留，并重新用試劑盒中提供的純化柱純化RNA。利用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，RNA質(zhì)量檢測完成后進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，USA)說明書。反轉(zhuǎn)錄程序為42℃ 60 min，70℃ 5 min。

1.3 Atg2a和Atg9b基因轉(zhuǎn)錄水平RT-qPCR檢測

Atg2a基因和Atg9b基因的mRNA序列在前期RNA-seq測序研究中已獲得(待發(fā)表)，利用Primer Premier Ver 6.0軟件設(shè)計引物，內(nèi)參基因選擇β-肌動蛋白(β-actin)基因，內(nèi)參基因的引物參考文獻[7]，引物序列見表1。RT-qPCR反應(yīng)組分為：cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol/μL)各0.2 μL，2x SYBR GREEN I Supermix(BIO-RAD)10 μL，7.6 μL H2O補足20 μL體系。擴增程序為：98℃ 30 s；98℃ 10 s，60℃ 1 min 40個循環(huán)，退火時收集熒光信號，熔解曲線為Bio-Rad CFX96默認程序。利用2-ΔΔCT法計算表達差異倍數(shù)，結(jié)果經(jīng)t-檢驗分析，P≤0.05認為差異顯著。

表1 本文所用的引物信息

Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，28SrRNA 和18SrRNA分離徹底、條帶清晰，28S條帶亮度約為18S條帶亮度的2倍，未見明顯彌散降解(圖1)。RNA質(zhì)量良好，可用于下游實驗分析。

圖1 總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Total RNA electrophoretic results

2.2 Atg2a和Atg9b基因轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果

RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麝鼠Atg2a和Atg9b基因在香腺繁殖期和非繁殖期中的轉(zhuǎn)錄水平都出現(xiàn)了顯著的差異。非繁殖期時麝鼠香腺中Atg2a基因的轉(zhuǎn)錄水平約為繁殖期時的43.7倍，Atg9b基因的轉(zhuǎn)錄水平約為繁殖期的16.6倍，轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(P≤0.05)(圖2)。熔解曲線結(jié)果顯示未出現(xiàn)明顯非特異性擴增(圖3和圖4)。

圖2 繁殖期與非繁殖期Atg2a基因和Atg9b基因轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.2 Differences in transcriptional levels of Atg2a and Atg9b genes in breeding and non-breeding stages

圖3 Atg2a基因熔解曲線Fig.3 Melting curve of Atg2a gene

圖4 Atg9b基因熔解曲線Fig.4 Melting curve of Atg9b gene

3 討論

通過RT-qPCR對繁殖期與非繁殖期的麝鼠香腺Atg2a基因和Atg9b基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的轉(zhuǎn)錄水平都表現(xiàn)為非繁殖期顯著高于繁殖期。因此，推測麝鼠在非繁殖期時香腺組織細胞的自噬水平高于繁殖期，原因可能有以下兩點：

首先麝鼠的香腺隨著繁殖期和非繁殖期周期性的發(fā)育和萎縮，本研究中10月末的樣品正處于麝鼠香腺組織快速萎縮過程，結(jié)合實驗結(jié)果推測，麝鼠香腺萎縮的過程中，自噬機制起到了重要作用。自噬被認為是Ⅱ型程序性細胞死亡，通過提高香腺細胞的自噬水平，細胞出現(xiàn)過度降解自身細胞器的現(xiàn)象，協(xié)同凋亡信號相關(guān)信號通路誘導(dǎo)的細胞凋亡過程，使香腺細胞大量程序性死亡，導(dǎo)致麝鼠香腺非繁殖期時的快速萎縮。研究證明細胞自噬的發(fā)生受到PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控[8]，同時雄激素具有激活PI3K/AKT通路的作用，非繁殖期時麝鼠睪丸快速萎縮，雄激素水平降低，這可能是誘導(dǎo)香腺細胞自噬水平上升的重要原因。

Zhang等的研究發(fā)現(xiàn)麝鼠的香腺與睪丸存在協(xié)同發(fā)育關(guān)系，且雄激素水平對麝鼠香腺組織的發(fā)育有顯著影響[9]，該推測可以很好地從分子機制方面解釋這一現(xiàn)象。另外，麝鼠的非繁殖期為10月末至翌年3月。該時期食物相對匱乏，在饑餓應(yīng)答作用下麝鼠自噬水平整體提高。本研究中未涉及麝鼠香腺以外的其他器官，后續(xù)試驗中會進一步驗證麝鼠在繁殖期和非繁殖期整體自噬水平的變化情況。

麝鼠香腺發(fā)育機制的研究尚處于摸索階段，很多分子機制尚待發(fā)掘，闡明麝鼠香腺的發(fā)育機制和其泌香機制是未來麝鼠相關(guān)研究的重點，也是未來更好發(fā)展麝鼠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的理論基礎(chǔ)。