德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株自溶活性的比較研究

張玉玉，于江，馬建軍，蘇文政，黃保華，吳家強(qiáng)，王可

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250100)

0 引言

乳酸菌自溶（autolysis）現(xiàn)象在發(fā)酵乳制品中普遍存在，是細(xì)菌在脅迫環(huán)境條件下維持菌群生存的一種自我保護(hù)機(jī)制。自溶過程中菌體釋放的胞內(nèi)蛋白酶、肽酶和酯酶等酶類，可將蛋白、多肽和脂肪分解成不同的風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，從而形成發(fā)酵乳制品的獨(dú)特風(fēng)味和質(zhì)地[1]。菌體自溶在不同發(fā)酵乳制品中對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)所起的作用并不相同，有利也有弊[2]。然而，當(dāng)發(fā)酵劑菌體自溶速率過快時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳制品產(chǎn)酸不足、凝乳不良及乳糖殘留過多等問題而影響乳制品的品質(zhì)和得率[3]。因此，乳酸菌自溶速率在一定程度上決定著發(fā)酵乳制品的質(zhì)量、風(fēng)味及產(chǎn)品生產(chǎn)周期。

德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）是一種被冠以國(guó)姓的細(xì)菌，是酸乳發(fā)酵的常用菌種，也是酸乳在貯藏期間發(fā)生后酸化的主要菌株[4]。德式乳桿菌保加利亞亞種具有調(diào)節(jié)胃腸道健康、增強(qiáng)免疫功能、抗癌抗腫瘤等重要的生理功能，是被規(guī)定為可用于保健食品的益生菌菌種之一[5]。在酸乳發(fā)酵劑生產(chǎn)中，德式乳桿菌保加利亞亞種菌體自溶則會(huì)制約菌株的增殖水平，不利于菌株的高密度培養(yǎng)，而在酸乳的貨架期菌體自溶影響酸乳的后酸化程度和品質(zhì)。因此，德式乳桿菌保加利亞亞種的自溶活性對(duì)酸乳制品發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要。

本研究針對(duì)分離自傳統(tǒng)和市售乳制品的德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，通過核酸溶出檢測(cè)法檢測(cè)其自溶活性，篩選出高、低自溶活性菌株，為開發(fā)優(yōu)良的酸乳發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

12株德式乳桿菌保加利亞亞種菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；改良MRS培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Tris base，美國(guó)Amresco公司；EDTA，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及處理

活化菌種接種改良MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌液作為后續(xù)試驗(yàn)的種子液。按4%（體積分?jǐn)?shù)）的接種劑量將種子液接種于改良MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)至目標(biāo)菌體濃度后，取樣，離心（5 000 rpm，4℃）10 min收集菌體。無菌生理鹽水洗滌菌體3次，滅菌TE緩沖液（50 mmol/L Tris，50 mmol/L EDTA）洗滌菌體1次，最后菌體用適當(dāng)?shù)腡E緩沖液重懸，使菌懸液的OD600值約為0.6。

1.2.2 自溶度檢測(cè)方法

1.2.2.1 核酸/蛋白溶出檢測(cè)法

取適量上述菌懸液離心去除菌體，測(cè)定上清液的OD260/OD280，記為A0。另取適量上述菌懸液置于37℃培養(yǎng)箱溫育t小時(shí)后，取樣離心去除菌體，測(cè)定上清液的OD260/OD280，記為At；剩余菌懸液超聲波冰浴破碎（400 W，工作3 s，間隙3 s）至菌液透明，取樣離心去除菌體，測(cè)定上清液的OD260/OD280，記為As。自溶度（%）=（At－A0）/（As－A0）×100%。

1.2.2.2 比濁法

取適量上述菌懸液測(cè)定初始OD600值，記為 A0。另取適量上述菌懸液置于37℃培養(yǎng)箱溫育t小時(shí)后，取樣測(cè)定OD600值，記為At。自溶度（%）=（A0－A t）/A0×100%。

1.2.3 掃描電鏡觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的正常菌體和自溶菌體用生理鹽水沖洗后，用2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH7.4）4℃固定2 h，磷酸緩沖液沖洗3次，再用1%鋨酸4℃后固定1.5 h。隨后，樣品用雙蒸水沖洗，逐級(jí)酒精脫水，醋酸異戊酯置換30 min，CO2臨界點(diǎn)干燥，粘托后表面噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體自溶檢測(cè)方法的確定

應(yīng)用核酸/蛋白溶出檢測(cè)法和比濁法對(duì)YF-L711菌株的自溶度進(jìn)行檢測(cè)，三種方法測(cè)得的自溶度均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但自溶度的增長(zhǎng)趨勢(shì)保持一致（圖1）。YF-L711菌株處理24 h內(nèi)自溶速率較大，隨后增速逐漸變緩。核酸溶出法（OD260）檢測(cè)得到的自溶度最大，24 h時(shí)自溶度約為71%，其次為蛋白溶出法（OD280）檢測(cè)得到的自溶度，24 h時(shí)自溶度約為62%，最小的為比濁法（OD600）檢測(cè)得到的自溶度，24 h時(shí)自溶度僅約為40%。由于核酸溶出檢測(cè)法最為靈敏，本研究選用核酸溶出檢測(cè)法檢測(cè)菌株處理24 h時(shí)的自溶度。

圖1 不同檢測(cè)方法測(cè)定的YF-L711菌株的自溶度比較

2.2 菌體不同生長(zhǎng)階段自溶度的比較分析

3株德式乳桿菌保加利亞亞種的生長(zhǎng)曲線見圖2，相對(duì)應(yīng)的不同生長(zhǎng)階段的菌株自溶度結(jié)果見圖3。YF-L711株、YOM 505株和CX株不同生長(zhǎng)階段自溶度的變化規(guī)律相似，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（4-12 h）菌體細(xì)胞具有最大的自溶度，進(jìn)入穩(wěn)定期（14-24 h）后菌體細(xì)胞的自溶度迅速降低，衰退期（24-48 h）菌體細(xì)胞的自溶度最低且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。

圖2 德式乳桿菌保加利亞亞種的生長(zhǎng)曲線

圖3 德式乳桿菌保加利亞亞種不同生長(zhǎng)階段的自溶度結(jié)果

2.3 不同菌株自溶度的比較分析

由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體的自溶度最高，且酸乳發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵菌株正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此本研究?jī)H檢測(cè)了12株德式乳桿菌保加利亞亞種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體自溶度。從圖4可以看出，MNGYR株、YF-L711株和YLCQ株的自溶度最高，均達(dá)到70%以上；YBT株、Y450B株、Y278F株和YLYX株的自溶度居中，在50%～60%之間；JB株、YOM 300株、YOM 505株、YOM 528株的自溶度最低，在50%以下。由此可見德式乳桿菌保加利亞亞種不同菌株之間的自溶度差異較大。

圖4 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的不同菌株處理24 h時(shí)的自溶度

2.4 不同菌株在自溶中的形態(tài)變化

掃描電鏡（圖5）顯示德式乳桿菌保加利亞亞種正常菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整且表面光滑；YF-L711株作為高自溶菌株，自溶菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞，胞內(nèi)物質(zhì)逐漸釋放出來；而YOM 300株作為低自溶菌株，自溶菌體細(xì)胞表面出現(xiàn)輕微萎縮且有部分細(xì)胞內(nèi)容物逸出的現(xiàn)象，但細(xì)胞表面沒有出現(xiàn)明顯的孔洞。結(jié)果說明低自溶菌株比高自溶菌株具有更強(qiáng)的抗逆能力，在不利環(huán)境下能夠更好的維持細(xì)胞的完整性。

圖5 正常菌體和自溶菌體的掃描電鏡照片（×6.0K）

3 討論

乳酸菌自溶活性常用的檢測(cè)方法有核酸/蛋白溶出檢測(cè)法、比濁法、胞內(nèi)酶檢測(cè)法和碘化丙錠染色-流式細(xì)胞儀法。由于核酸/蛋白溶出檢測(cè)法和比濁法操作簡(jiǎn)便，本研究比較了其測(cè)定菌體自溶活性的靈敏性，結(jié)果顯示上述方法測(cè)定的德式乳桿菌保加利亞亞種的自溶活性變化規(guī)律一致，但核酸溶出檢測(cè)法最為靈敏，因此本研究采用核酸溶出檢測(cè)法測(cè)定德式乳桿菌保加利亞亞種不同菌株的自溶活性。

據(jù)報(bào)道細(xì)菌自溶與胞內(nèi)自溶酶有非常密切的相關(guān)性，自溶酶水解細(xì)胞壁從而導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性受到破壞甚至表面出現(xiàn)孔洞，致使胞內(nèi)物質(zhì)逸出[6-7]。本研究中掃描電鏡觀察德式乳桿菌保加利亞亞種自溶菌體也證實(shí)自溶導(dǎo)致了菌體細(xì)胞壁受到輕微或嚴(yán)重的破壞，胞內(nèi)物質(zhì)逸出。正常情況下，自溶酶對(duì)菌體細(xì)胞的分裂作用是有序進(jìn)行的，不會(huì)導(dǎo)致菌體的自溶，而一旦在脅迫條件下將導(dǎo)致作用失序而引起自溶[8]。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌快速增殖，細(xì)胞的生命活動(dòng)活躍，負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂的自溶酶大量產(chǎn)生，所以處于此階段的細(xì)胞自溶活性最高。細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞的活躍度顯著降低，自溶酶的生成量減少，所以自溶活性顯著降低。細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期后，部分菌體開始死亡，自溶酶的生成量更少，所以自溶活性持續(xù)降低。

不同乳酸菌甚至同種屬的不同菌株在相同條件下的自溶活性不盡相同。有研究顯示菌體自溶對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)和保質(zhì)期影響極為顯著，自溶活性較高的乳酸菌菌株在酸乳發(fā)酵過程中產(chǎn)酸性能更優(yōu)，酸乳后酸化的程度相對(duì)較低[9-10]。本研究采用核酸溶出檢測(cè)法分析比較了12株德式乳桿菌保加利亞亞種在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的自溶活性，篩選到了高自溶活性菌株和低自溶活性菌株，為進(jìn)一步研究德式乳桿菌保加利亞亞種自溶活性的調(diào)控和改造以及開發(fā)優(yōu)良酸乳發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。