體外輔助生殖用耗材產品環(huán)氧乙烷殘留限量的風險探討

許耘，田佳鑫，楊曉冬，鄧潔

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術審評中心，北京，100081）

近年來，隨著人類輔助生殖技術（ART）的不斷成熟，輔助生殖技術用相關醫(yī)療器械產品也逐漸增多，出現(xiàn)了諸如穿刺取卵針、顯微注射針、胚胎移植導管、培養(yǎng)皿等耗材類醫(yī)療產品。由于輔助生殖用醫(yī)療耗材的作用對象是配子、合子及不同細胞階段的胚胎，這些細胞對微環(huán)境的變化十分敏感，ART過程中微小的環(huán)境因素都會對胚胎的生理學、遺傳學產生影響。有研究表明，甲醛殘留、葡萄糖含量、血清濃度等均有可能影響卵裂率[1]，影響DNA甲基化及基因印記過程，從而使子代出現(xiàn)印記異常并可能導致出生缺陷的發(fā)生[2]。這些因素對未來個體發(fā)育影響深遠、作用難以磨滅。

正是因為胚胎細胞的敏感性和分化潛能，歐洲替代方法驗證中心（the European Center for the Validation of AlternativeMethods, ECVAM）提出的胚胎干細胞試驗（embryonic stem cell test, EST）作為體外篩選和評價受試物發(fā)育毒性的手段已為學術界普遍接受[3]。在EST的研究中發(fā)現(xiàn)，對受試物質毒性的評價和檢測終點不應僅僅考慮細胞毒性，還應考慮胚胎毒性。原因在于有些受試物在低濃度時即可抑制干細胞分化, 具有較強的胚胎毒性；而其細胞毒性作用濃度（包括成纖維細胞和干細胞的細胞毒性作用濃度）卻比胚胎毒性濃度高出很多個數(shù)量級[4]。

鑒于此，在對輔助生殖用耗材醫(yī)療產品進行生產設計和技術審評時，相關的生物學評價項目及評價標準以及生產工藝過程中各種化學物質的殘留限量標準也應做進一步的驗證。

本文綜述環(huán)氧乙烷滅菌殘留量對胚胎細胞的影響并探討如何合理制定輔助生殖用耗材類醫(yī)療器械產品中環(huán)氧乙烷殘留限量的要求。

1 環(huán)氧乙烷的毒理作用機制

環(huán)氧乙烷（ethylene oxide，EO）是一種化學性質活潑的雜環(huán)氧化物滅菌劑。環(huán)氧乙環(huán)在低溫下為無色液體，沸點10.8℃，在常溫下為無色氣體，易燃、易爆、空氣中濃度達3%以上，即有爆炸危險。環(huán)氧乙烷的殺菌原理是通過對微生物蛋白質分子的烷基化作用，干擾酶的正常代謝而使微生物死亡。其主要優(yōu)點是穿透力強、殺菌譜廣，對材料破壞力小。因此，環(huán)氧乙烷滅菌是醫(yī)療器械產品常用的低溫滅菌方法。然而作為化學滅菌劑，環(huán)氧乙烷對于人體也是致癌和致畸化學物質。關于環(huán)氧乙烷的毒性及其在醫(yī)療器械產品中殘留量的研究一直受到關注。

在動物致癌研究中，吸入環(huán)氧乙烷可導致包括白血病、腦腫瘤和乳腺腫瘤，而食入或皮下注射環(huán)氧乙烷會在接觸部位形成腫瘤。1994年，國際癌癥研究機構（IARC）依據(jù)環(huán)氧乙烷的作用機理，重新將其劃分為人類致癌物質（一類）。此外，環(huán)氧乙烷還可與生產環(huán)境中的氯離子反應，生成2－氯乙醇（ECH），ECH具有輕微的致突變性，具有產生胎兒毒性和致畸性改變的潛能，并對肺、腎、中樞神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)有損傷[5]。

環(huán)氧乙烷的毒理作用機制在于它具有很強的親電子性, 易與核酸和蛋白質分子的親核中心反應。環(huán)氧乙烷對DNA堿基的烷化作用被認為是其一系列基因毒性的分子基礎。理論分析、離體模擬反應以及分離的體內烷化DNA分析結果都說明EO并非與DNA鏈上不同親核中心隨機發(fā)生烷化反應的，而是優(yōu)先與DNA鏈上鳥嘌呤的N7位反應, 生成N 7-(2-羥乙基)-鳥嘌呤加合物，該加合物可占EO與離體DNA 反應產物總量的90 %。EO也會與蛋白質肽鏈上的親核中心發(fā)生反應，反應可能發(fā)生在半胱氨酸的巰基，組氨酸咪唑環(huán)Nl位、N3 位氮原子以及肽鏈末端纈氨酸。EO-血紅蛋白加合物的生成水平顯著高于相應的DNA加合物生成水平[6]。

2 環(huán)氧乙烷對生殖細胞的影響

環(huán)氧乙烷對生殖細胞影響的研究起步很早, 研究對象從細菌、嚙齒類、靈長類直至人類都有涉及,作用水平包括整體水平、組織器官水平、細胞染色體水平以及DNA、蛋白質等生物大分子水平。

中國科學院上海昆蟲研究以黑腹果蠅為材料，檢測吸入環(huán)氧乙烷對不同發(fā)育階段的果蠅生殖細胞，包括成熟精子、精細胞和精母細胞的影響，結果顯示環(huán)氧乙烷對果蠅生殖細胞具有一定的誘變作用[7]。

通過對雄性小鼠及大鼠吸入環(huán)氧乙烷試驗顯示，在亞慢性毒性試驗中較低濃度EO暴露組均觀察到精子活動率下降，提示精子能量代謝發(fā)育狀況受影響，環(huán)氧乙烷各劑量組的精子畸形率均比空白對照組高，提示精子的正常生長發(fā)育受到干擾，嚴重的精子畸形可影響受孕能力[8-9]。

環(huán)氧乙烷是小分子的水溶性化合物（分子量為44），可以容易地通過血睪屏障而影響生殖細胞；許多研究已證明生殖細胞的DNA 和蛋白質在EO暴露后被烷化而形成有基因毒性的加合物，在哺乳動物生殖細胞中的顯性致死突變及遺傳性的易位都是EO引起的基因突變。這種突變也可能發(fā)生在基因表達的分化中，包括遺傳信息轉錄和翻譯后的后幾個階段。環(huán)氧乙烷可能作用于各級生精細胞膜或細胞內的蛋白質或其它活性物質中的巰基，進而影響生精細胞的結構和功能，造成生精細胞發(fā)育障礙和成熟過緩甚至抑制精子的發(fā)生[10]。

3 環(huán)氧乙烷的基因毒性

早在上世紀90年代Dellarco等報道了EO在哺乳動物測試系統(tǒng)中導致基因突變和染色體畸變[11]。陸靜芬等通過小鼠吸入EO試驗觀察到EO使小鼠骨髓細胞分裂中的染色體畸變，主要為裂隙、斷裂及斷片, 且隨著濃度的增加而加劇。并發(fā)現(xiàn)染色體斷裂位置較多是在著絲粒區(qū)域，故推測著絲粒區(qū)可能是受EO影響的染色體敏感區(qū)域，并提出斷裂、斷片現(xiàn)象可作為一個敏感的遺傳毒理學參數(shù)，作為測定受EO毒性影響的染色體損傷指標[12]。

Ames試驗是一種常規(guī)的遺傳毒性檢測方法，由于其能檢測DNA序列的突變，是評價化學物致癌性的重要手段。如圖1所示將Ames試驗用于篩選誘變劑：兩種陽性誘變劑（左為敵克松，右為疊氮鈉）在不加S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，均可導致測試菌株的回變菌落數(shù)增多（注：無誘變劑時，僅見少量自發(fā)突變菌落），說明其具有致突變作用，并且可通過化合物所致回變菌落數(shù)的多少對其致突變作用的強弱進行初步判斷，乃至用于致癌物的篩選。

圖1 Ames試驗用于篩選誘變劑。左：TA97菌株陽性誘變劑敵克松不加S9的菌落回變數(shù)；右：TA1535菌株陽性誘變劑疊氮鈉不加S9的菌落回變數(shù)Fig. 1 Screening of mutagens using Ames test. Left∶ the revertant colonies of TA97 treated by Dexonin without S9; Right∶ the revertant colonies of TA1535 treated by SA without S9

張建軍等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中環(huán)氧乙烷的殘留在活化和非活化兩種條件下均能對Ames試驗中TA100、TA1535菌株有致突變性，表現(xiàn)為TA100菌株的回變菌落數(shù)增多，約為自發(fā)回變數(shù)的1.5倍；TA1535菌株的回變菌落數(shù)增多，約為自發(fā)回變數(shù)的10倍。這表明EO作為直接的烷化劑，具有與DNA和蛋白質形成加合物的化學活性，體內外均可導致突變并引發(fā)多物種的致畸變作用[13]。對于醫(yī)療器械中環(huán)氧乙烷及2-氯乙醇殘留量的限定，目前應用最廣泛的標準為國際標準化組織（ISO）制定的ISO 10993-7，該標準等同轉化為GB16886.7《醫(yī)療器械生物學評價?第7部分環(huán)氧乙烷滅菌殘留量》。以單個培養(yǎng)皿質量約為16 g計，EO殘留量約為160μg，以單個培養(yǎng)皿面積約為64cm2計，EO殘留量約為640 μg，表明較低劑量下仍具有很強的致突變能力。

發(fā)育毒性是指出生前后接觸外源性理化因素引起的在子代的壽命期內出現(xiàn)的任何對發(fā)育有害的表現(xiàn)。能造成發(fā)育毒性的物質稱為發(fā)育毒物。出生前的發(fā)育毒物應是在未誘發(fā)母體毒性的劑量下產生發(fā)育毒性的物質[14]。在著床前期接觸毒物造成胎兒畸形的例子包括環(huán)氧乙烷、甲基亞硝脲等。著床前期又分為受精、卵裂、囊胚形成，這些過程也正好是體外輔助生殖技術關鍵作用時期。

4 體外輔助生殖用耗材產品EO殘留的風險及控制措施

對于人類體外輔助生殖用耗材類產品的生物相容性評價，目前除了參考GB/T16886系列標準進行相關的評價之外，一般還應進行體外鼠胚試驗和人精子存活試驗。然而，對胚胎毒性的評價并不能以細胞毒性的結果為依據(jù)，因為受試物對胚胎細胞的影響并不僅僅體現(xiàn)在細胞毒性，還體現(xiàn)在細胞分化等各個階段的改變，也就是說，受試物產生胚胎毒性和細胞毒性的劑量是有差別的。有些受試物在抑制胚胎細胞分化和造成胚胎細胞毒性的濃度并不同，因此除了對細胞毒性評估之外，通過受試物對胚胎細胞的早期階段到最終分化成特定細胞的全過程的檢測，可以對受試物是否具有胚胎毒性做出正確的判斷。

相關生產企業(yè)、使用單位及監(jiān)督檢查部門都應該對環(huán)氧乙烷在體外輔助生殖用產品的特殊影響提高防范意識。此類產品最好不采用環(huán)氧乙烷滅菌。若為環(huán)氧乙烷滅菌，應嚴格規(guī)定紙塑包裝、環(huán)氧乙烷限量及解析時間，并對解析時間進行驗證。送檢樣品應能代表批量產品的解析條件，其檢驗結果應能反映出批量產品中的殘留量。建議將相關信息明確在產品標簽上。

生產企業(yè)在產品放行時應考慮到EO 殘留量，建議對一年中不同時期的通風、溫度等條件的變化進行數(shù)據(jù)采集和分析，繪制擴散曲線，根據(jù)擴散曲線數(shù)據(jù)進行放行。

5 總結

環(huán)氧乙烷的殘留對體外輔助生殖用相關醫(yī)療產品的影響比其他醫(yī)療器械更為復雜，這不僅僅體現(xiàn)在該類器械對所接觸細胞的細胞毒性，還體現(xiàn)在胚胎細胞分化各個階段的改變。因此，對于體外輔助生殖用醫(yī)療產品中環(huán)氧乙烷殘留的風險分析及控制措施應更加審慎。